九肋鳖形态及遗传特性分析_万刚.pdf

doi:10.7541/2023.2022.0389九肋鳖形态及遗传特性分析万 刚1 曾嘉伟1 肖何威1 熊 钢2 靳利忠1 王晓清1*胡亚洲1*(1.湖南农业大学动物科学技术学院,长沙 410128;2.湖南生物机电职业技术学院动物科学与技术系,长沙 410127)摘要:研究在湖南洞庭湖及沅江水域内开展中华鳖(Pelodiscus sinensis)种质资源调查,发现中华鳖中存在“九肋鳖”,为了解其资源分布、形态特征以及遗传特性,从形态指标、线粒体DNA及骨骼发育基因多态性入手,比较研究九肋鳖(9对肋骨,简称R9)与八肋鳖(8对肋骨,简称R8)的形态及分子遗传特性。结果显示:(1)从湖南省沅江、益阳、常德和岳阳地区的12222只人工养殖中华鳖群体中共筛选出331只九肋鳖,其在养殖中华鳖群体中占比为2.2%3.1%。(2)九肋鳖背甲内胸椎数为11枚,肋骨9对,比八肋鳖多1枚胸椎和1对肋骨。(3)九肋鳖背甲宽/背甲长、后侧裙边宽/背甲长显著小于八肋鳖,体高/背甲长显著大于八肋鳖。(4)九肋鳖CO I、Cytb、12S rRNA基因与中华鳖序列的同源性达到99%以上,进化树分析显示九肋鳖与中华鳖群体聚为一支,与中华鳖地理群体间均存在共享单倍型,未找到群体特异性标记。(5)九肋鳖与八肋鳖的RUNX2和VRTN基因外显子上共检测到4处突变位点,即g.977380 CT、g.6014427CT、g.6015734AC及g.6015864AC位点,且VRTN基因的g.6015864AC突变与中华鳖胸椎数之间存在显著关联(P0.05)。以上研究表明,九肋鳖属于中华鳖,其形态结构与八肋鳖的区别在于多1枚胸椎和1对肋骨,VRTN基因g.6015864AC位点可能与中华鳖多脊椎性状有关。研究结果对了解中华鳖种质特性及种业创新具有较重要的理论参考价值。关键词:资源调查;形态;遗传特性;种质创新;九肋鳖中图分类号:Q172 文献标识码:A 文章编号:1000-3207(2023)09-1534-11 中国现存鳖科(Trionychidae)动物共有4属8种1,即鼋(Pelochelys cantorii)、斑鳖(Rafetus swinhoei)、山瑞鳖(Palea steindachneri)、中华鳖(Pelodiscussinensis)、砂鳖(Pelodiscus axenaria)、东北鳖(Pelo-discus maackii)、小鳖(Pelodiscus parviformis)和黄山马蹄鳖(Pelodiscus huangshanensis)2。最为常见的是中华鳖,因其具有重要的食用和药用价值,中华鳖在广东、江西、浙江和湖南等中国南方地区被广泛养殖,年产量超过30万吨3。在湖南省境内开展中华鳖种质资源调查时发现中华鳖中存在“九肋鳖”。我国传统中医药典本草图经对九肋鳖就有相关记载:“鳖生丹阳池泽,今处处有之,以岳州沅江其甲有九肋者为胜4”。现代学者对九肋鳖也有相关简单描述。张幼敏等5指出九肋鳖在湖南人工养鳖群体中已经占1%2%。据伍惠生6报道,九肋鳖背甲肋骨数为9对,比中华鳖背甲肋骨数多1对。因此他认为九肋鳖很可能是一种较原始的鳖类,而不是中华鳖的变异种。目前对湖南省九肋鳖的资源分布、形态特征、分类地位及多肋骨性状等信息仍不清楚。本研究以湖南省人工养殖中华鳖群体为研究对象,调查九肋鳖在养殖中华鳖群体中的比例;比较研究九肋鳖和中华鳖的形态差异,利用线粒体CO I、12S rRNA和Cytb基因解析九肋鳖系统分类地位,并研究九肋鳖RUNX2和VRTN基因的多态位点及其与多肋骨数性状的相关性,以揭示九肋鳖形态学特征和遗传特性,旨在为进一步选育鳖新品种(系)提供科学依据。1 1 材料与方法 1.11.1 试验材料试验所用九肋鳖于2020年10月至2022年01月期间采自湖南省常德、益阳和岳阳等地区的中华鳖人工养殖基地(图 1)。利用便携式X光机(宁波惠鑫仪器科技有限公司75Y型便携式)对养殖鳖群体第 47 卷 第 9 期水 生 生 物 学 报Vol.47,No.9 2023 年 9 月ACTA HYDROBIOLOGICA SINICAS e p.,2 0 2 3 收稿日期:2022-09-28;修订日期:2022-11-15基金项目:国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”重点专项(2018YFD0900200)资助 Supported by the National Key R&D Program“Blue Granary Technology Innovation”Key Projects(2018YFD0900200)作者简介:万刚(1998),男,硕士研究生;主要从事水产动物遗传育种研究。E-mail:通信作者:王晓清(1964),E-mail: 胡亚洲(1989),E-mail:*共同通信作者进行X-ray扫描,根据背甲肋骨数(R9)筛选出九肋鳖,并计算九肋鳖占比。1.21.2 试验方法形态指标测量挑选62只2+龄的九肋鳖,另于常德市河洲水产有限公司购买相同规格八肋鳖62只。用电子天平称重(Body weight;BW),精确到0.01 g。参照中华鳖国家标准(GB21044-2007)测量7项可量性状体长(Body length;BL)、背甲全长(Back shell total length;BSTL)、背甲宽(Backshell width;BASW)、腹甲长(Belly shell length;BE-SL)、腹甲宽(Belly shell width;BESW)、体高(Bodydepth;BD)和后侧裙边宽(Lateral skirt width;LSW)。形态指标用游标卡尺测量,所有测量数据均精确到0.01 mm7。骨骼X光片及背甲标本制作利用日本岛津XUD150L-F型500MA高频X光机对九肋鳖及八肋鳖做 X-ray 扫描,拍摄X光片。参照动物骨骼标本制作方法8,制作九肋鳖和八肋鳖背甲标本,对背甲标本进行观察、测量和描述,并拍照保存。组织DNA提取、扩增和测序分别采集九肋鳖和八肋鳖新鲜肌肉组织,使用液氮进行保存并带回实验室,全部转移到80冰箱中保存。参考湖南艾科瑞生物工程有限公司提供的试剂盒说明书的方法(通用型基因组DNA抽提试剂盒,批号:AG21011)提取样品基因组DNA。用10 mg/mL(1%)的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量,用紫外分光光度计测定OD260和OD280,(A260/A2801.8)取出部分DNA样品将浓度调至50 ng/L,保存于20备用。根据GenBank数据库提供的中华鳖线粒体基因组(No.MG431983.1)、RUNX2(No.102461064)及VRTN(No.MG431983.1)基因的DNA序列信息,使用Primer Premeier5.0软件设计引物以扩增线粒体CO I、Cytb、12S rRNA基因序列及VRTN和RUNX2基因外显子序列,送由北京擎科(长沙)生物技术有限公司合成。表 1中列出本研究扩增所需引物的序列。PCR反应体系共25 L体系,包括2Taq PlusMaster Mix 12.5 L,正反引物各0.5 L,模板DNA 0.5 L,补充 ddH2O至总体积为25 L。条件为94预变性5min;34个循环,94变性30s,60退火30s,72延伸45s;最后72延伸10min,4保存。经1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物大小,确认后PCR产物交由生工生物工程(上海)有限公司纯化、双向测序。1.31.3 数据处理形态指标分析为消除个体大小差异对各项参数的影响,故将各项参数转化为比例性状参数进行矫正,除体重以外7项数据均以背甲长为基数,得到6项比例参数7,运用SPSS 23.0软件对各指标进行主成分分析,得到各主成分的特征值和贡献率,并根据得分情况绘制第一、第二主成分的散点图。运用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析,采用LSD法(方差齐性)和Tamhane方差分析法(方差非齐性)分析两种间的差异。线粒体DNA序列分析使用DNA Star软件对序列进行比对、剪切,并辅以人工校正。利用Dnasp5.0软件统计序列碱基组成和遗传多样性参11401130112011101140113011201110300290280300290280采样点河流 River湖泊 Lake沅江 Yuanjiang洞庭湖 Dongting lake050 km25图 1 九肋鳖采样点示意图Fig.1 Sampling point diagram of Chinese soft-shelled turtle with nine pairs of ribs9 期万 刚等:九肋鳖形态及遗传特性分析1535数(如单倍型数、单倍型多样性和核苷酸多样性)。另外从NCBI GenBank上下载鳖属相关序列,采用MEGA7.0软件中的邻接法(Neighbor-joining,NJ)构建系统发育树。脊椎数发育相关基因序列分析参考中华鳖VRTN和RUNX2基因的DNA序列信息,利用DNAStar等软件进行序列比对,寻找SNP位点,然后分析60只鳖(其中九肋鳖与八肋鳖个体各30只)的基因型。利用Popgene 32软件计算各位点的等位基因频率(Allele frequency)、基因型频率(Genotype fre-quency)、有效等位基因数(Number of effective al-leles,Ne)、多态信息含量(Polymorphism informationcontent,PIC)和杂合度(Heterozygosity,He),并进行Hardy-Weinberg平衡检验。2 2 结果 2.12.1 九肋鳖筛选及占比利用便携式X光机对湖南省益阳、常德和岳阳地区的12222只人工养殖中华鳖群体进行筛选,共筛选出331只九肋鳖,得到九肋鳖在调查区域中分布比例为2.2%3.1%(表 2)。2.22.2 传统分类鉴定九肋鳖与八肋鳖形态对比九肋鳖与八肋鳖在体背颜色较一致,呈橄榄绿或墨绿色,腹部有花斑或无。背甲由颈骨板、肋骨板和椎骨板呈锯齿状嵌合的一整块硬质骨板。从背甲内表面来看,中央椎骨板上附着胸椎,胸椎两旁各有一根肋骨,与肋骨板愈合9。对两种鳖背甲比较发现,九肋鳖背甲略显狭长,背甲内表面胸椎为11枚,八肋鳖胸椎共10枚。九肋鳖最后一枚胸椎较小,髓弓的背侧部分与背甲椎骨板愈合,较前一枚胸椎向下弯曲度更大,且最后一枚胸椎距背甲后缘较近。第9对肋骨较短小,从第1011胸椎相连接处向外伸出,前端突出于肋板的外侧,尾端与肋骨板相连,相较于前8对肋骨,第9对肋骨与第8对肋骨的间距较小(图 2和图 3)。形态主成分分析用于形态参数测量的九肋鳖、八肋鳖各62只,将6项可量性状比例参数进行主成分分析,共获得2个主成分,KMO(Kaiser-Meyer-Olkin)值为0.832,适合用主成分分析法,各主成分的贡献率见表 3。2个主成分对变异的累积贡献率达72.328%,各个主成分的方差贡献率分别为54.421%和16.907%。体长/背甲长、背甲宽/背甲长、腹甲长/背甲长和腹甲宽/背甲长是主成分1变异贡献的主要形态指标,可见九肋鳖体形长度和宽度是引起其与八肋鳖形态差异的主要指标。第2主表 1 本研究中扩增序列的引物信息Tab.1 Primer information of the amplified sequences in thisstudy基因Gene引物序列Primer sequence(53)Tm()扩增区段Amplific-ationsection长度Productsize(bp)CO ICTCCATACTCACTCCAATCGGTATGGTCATGAAAGTGTA60CDS120712SrRNAAAAGCATGGCACTGAAGACGCTTTCAATTTTCCCTTGCGGTAC60CDS1285CytbAGCCATACATTACTCACCGTGAAGGATGGAGGATGT60CDS849RUN