辣椒CaWRKY8基因克隆及胁迫下的表达分析.pdf

西北植物学报，（）：收稿日期：；修改稿收到日期：基金项目：国家自然科学基金（）；江苏省农业重大新品种创制项目（）；现代农业产业技术体系建设专项资金（）作者简介：刁玄章（），男，在读硕士研究生，主要从事辣椒遗传育种研究。：通信作者：高青海，教授，硕士研究生导师，主要从事蔬菜优质高产栽培的研究。：辣椒 基因克隆及胁迫下的表达分析刁玄章，王述彬，刁卫平，潘宝贵，戈伟，高青海（安徽科技学院 农学院，安徽凤阳 ；江苏省农业科学院 蔬菜研究所，江苏省高校园艺作物遗传改良重点实验室，南京 ）摘要：为了揭示辣椒基因功能，以辣椒 为实验材料，克隆得到 基因全长 的 序列，命名为 。生物信息学分析表明，该基因含有一个 完整开放阅读框（），编码 个氨基酸残基。氨基酸序列分析显示，编码的蛋白含有个 结构域，属于 。氨基酸序列比对结果表明，与辣椒、马铃薯、番茄基因组中预测的、烟草基因组中预测的 和猕猴桃的氨基酸序列之间均具有高度的保守性。实时荧光定量分析表明，受盐、高温、干旱和辣椒疫霉菌诱导表达；其中 的表达量在盐和干旱处理下达到峰值，分别是对照的 倍和 倍，在高温和疫霉菌处理下 达到峰值，分别是对照的 和 倍。以上研究结果表明，基因在辣椒响应胁迫进程中发挥着重要作用。关键词：辣椒；克隆；胁迫；生物信息学中图分类号：；文献标志码：，（，；，）：，（），：；辣椒（）是一年生或有限多年生植物，生长发育过程中经常受到生物和非生物胁迫因素的影响，如病原体、干旱和高温，从而导致品质下降、产量降低。为了抵制这些不利环境因素影响，植物进化出一套复杂的防御反应机制，在这套防御反应机制中，最重要的环节就是通过蛋白互作或转录因子和启动子中的顺式作用元件互作，组成信号传导途径传递胁迫刺激，进而启动胁迫应答相关基因的表达，最后通过产生相应的蛋白和代谢产物发挥作用以适应胁迫，以此提高植物在胁迫环境下的抗逆性。转录因子在植物中分布广泛，是植物中最大的 转 录 因 子 家 族 之 一。自 从 第 一 个 编 码 蛋 白 的 （）从 甘 薯 中 克 隆 出来，各种植物中都陆续鉴定出 蛋白。而且随着越来越多的植物基因组测序工作的完成，转录因子全基因组范围内的鉴定和功能分析已变得越来越便利。转录因子家族的 结合域都具有一个显著的共同特征，即都含有个 结构功能域。基于 结构功能域的数目和锌指结构的特征，一般可以分为类：第类含有个 结构域，锌指结构为型，如最早被鉴定的 、和 等；第类只含有个 结构域，锌指结构也为型，根据保守区氨基酸的差异可将第类进一步分为个亚类，分别为（）、（）、（）、（）和（），包括了大多数的 转录因子，如 和 等；第类为只含有个 结构域，且锌指结构为型，如从烟草中分离出来的 和 。不管是 残基还是锌指结构都是构成 结合蛋白所必不可少的。大量关于 转录因子鉴定和功能分析的研究表明，蛋白在各种生物和非生物胁迫的信号传导和表达调控中发挥重要作用。番茄 、和 基因的表达在干旱胁迫下显著上调，此外，个 基因的表达在盐胁迫下也显著上调。诱导 基因过表达加速了 蛋白基因的表达，进而提高了转基因杨树对病原体的抗性。然而，目前关于辣椒 转录因子的研究并不多。同时，在调节耐热胁迫和青枯菌感染方面发挥了重要作用。和 过表达分别对青枯雷尔氏菌感染的抗性产生正向和负向调节 。辣椒基因还被证明显示出一定的组 织 特 异 性 和 诱 导 表 达 特 性 。、和 分别在青枯雷尔氏菌、辣椒 青 霉 菌 和 接 种 下 显 示 诱 导 的 表 达模式。基于项目组前期在辣椒全基因组测序数据库中共鉴定出 个 转录因子，本研究以辣椒 为研究对象，分析其在辣椒高抗疫病材料 经不同生物胁迫和非生物胁迫下的表达情况，以期为深入研究辣椒 转录因子在生物和非生物胁迫下的分子机理提供参考。材料和方法 植物材料培养挑取籽粒饱满种子用纱布包好，热水浸种 ，然后在室温条件下让种子充分吸水 ，最后播种于 孔穴盘中，每穴粒种子。子叶出土后，将幼苗转移到光照培养箱中长日照条件下生长（光照，黑暗），温度为 （昼）（夜），当辣椒幼苗有片真叶时，用于胁迫处理。生物胁迫处理向在 培养基培养的疫霉菌中加入 灭菌超纯水，将培养皿放入冰箱 ，再取出放在室温 左右，在显微镜下观察游动孢子，用血球计数板调整其浓度为 备用，取备用疫霉菌溶液喷淋辣椒根茎部，用无菌水喷洒作对照。在 相对湿度下生长，分别于、和 后取样，液氮速冻，超低温保存备用，生物学重复次。非生物胁迫处理将幼苗放入光照培养箱内（，光照强度 ）进行高温胁迫处理；分别以 溶液、甘露醇溶液喷淋辣椒根茎部，进行盐胁迫和干旱胁迫处理，以清水喷洒作为对照。分别于、和 后取样，液氮速冻，超低温保存备用，生物学重复次。方法 基因克隆根据辣椒基因组数据库（：）中 基期刁玄章，等：辣椒 基因克隆及胁迫下的表达分析因的序列在 及 设计引物（表），委托擎科新业生物技术有限公司（南京）合成。以 作为扩增模板，使用 基因的引物，反应程序为：预变性 ；变性，退火，延伸 ，个循环（变性延伸）；延伸 ，保存。琼脂糖凝胶电泳（，）检测 产物，质量合格后回收相应的 片段，回收片段克隆至 载体（，南京），热击法转化 ，挑选阳性单克隆送擎科新业生物技术有限公司（南京）测序，得到目的片段序列。生物信息学分析利用 程序（：），对 基因进行开放阅读框（）预测；根 据 克 隆 所 得 的 序 列，利 用 的 在线分析工具对氨基酸序列进行同源性比对，并结合 构建 分子进化树。在胁迫下的表达分析提取处理后辣椒叶片总，并按照试剂盒的方法反转录得到 （，大连）。根据辣椒 序列 设 计 引 物（表），以 辣 椒 （登录号为 ）作为内参基因，引物由 生物技术有限公司（南京）合成。采用德国罗氏诊断有限公司的 实时荧光定量 仪，进行实时荧光定量 ，反应体系（）包括 、上下游引物，（），。反应程序：预变性 ；，个循环。处理个生物学重复，个技术重复，所得数据采用 法计算 的相对表 达 量，采 用 进 行 平 均 数 统 计，以 软件进行方差分析，绘制 分析图。结果与分析 辣椒 基因的克隆以辣 椒 为 模 板，用 引 物 （表）扩增出 左右目的片段（图），将目的片段回收后连接转化，挑取阳性克隆用引物检测后测序。测序结果显示，该片段与辣椒基因组数据库中目的片段完全一致，大小为 ，该基因从起始密码 到终止密码具有一个完整的开放阅读框（），编码 个氨基酸，命名为 。辣椒 基因氨基酸序列同源性分析对辣椒 基因的氨基酸序列在 中进行 在线比对分析，结果显示其蛋白质含有个 结构域（图）。应用 软件进行多重比对，将辣椒 基因编码的氨基酸序列与其他物种的基因编码的氨基酸序列进行比对。比对结果表明，辣椒 氨基酸与其他物种的氨基酸有高度的相似性，属于 家族中的 （图）。辣椒 蛋白进化树分析使用 中 工具对辣椒 图辣椒 基因 扩增 表所用引物信息 引物名称 引物序列 （）用途 片段大小 荧光定量 内参 荧光定量 基因克隆 西北植物学报 卷方框表示 氨基酸保守区域 ；灰色底纹表示锌指结构图 核苷酸序列及预测氨基酸序列 ；氨基酸序列进行同源性检索，对检索到的数据再利用 软件构建系统进化树（图）。结果表明，克隆的辣椒 基因与辣椒 （）一致性较高，此外，与马铃薯 （）和番茄 （）也有较高的一致性。辣椒 对胁迫的应答高温、干 旱、盐 害 等 非 生 物 胁 迫 均 能 诱 导 的 表 达（图）。本 研 究 中，利 用 溶液处理样品，结果表明该辣椒样品中 基因的相对表达量呈倒型。其中，处理时 基因的相对表达量达到峰值，表达量为对照的 倍；处理 时又达到一个高峰，随后又逐渐降低（图）。基因在 高温胁迫处理时表达量降低，随后迅速升高到达峰值后下降，在 时表达量达峰值，为对照的 倍（图）。在 甘露醇的处期刁玄章，等：辣椒 基因克隆及胁迫下的表达分析图 多序列比对 西北植物学报 卷图辣椒 与 中相似序列的进化树分析 相同处理内不同小写字母表示不同时间差异显著图 基因在胁迫处理后的表达分析 理下，以相对较高的强度表达，每组处理均显示出显著的上调表达，在处理时，表达量达到峰值（图），为对照组的 倍，之后虽有所下降，但一直维持一个较高的表达水平。本研究表明，种 非 生 物 胁 迫 中，干 旱 胁 迫 处 理 后 基因表达上调最为显著；在盐胁迫处理下，基因的相对表达量较对照组相比略微上调。辣椒 同样受到生物胁迫的诱导（图）。辣椒幼苗在接种 辣椒疫霉菌后，基因的相对表达量显著上调，总体呈现出倒型的趋势。处理、后表达量与对照组相比增幅较大；在 时，相对表达量达到峰值，为对照组的 倍。讨论植物在生长发育的整个生命周期过程中，面临着各种非生物胁迫如干旱、盐和高温等的影响。为了生存，植物进化出一套完整的调控网络机制来调节自身适应胁迫。基因家族不仅参与植物的生长发育及形态建成，同时在调节植物适应这些非生物胁迫的过程中也发挥着重要的功能。在抗干旱、盐胁迫方面，大豆中的 转录因子通过调节 和 参与盐及干旱胁迫。通过基因芯片鉴定拟南芥中的个 蛋白 、受 盐 胁 迫 诱 导 表达。本研究结果表明，盐处理下辣椒 基因的相对表达量呈倒型，处理时达到峰值，表达量为对照的 倍。随着处理时间的延长，相对表达量升高后逐渐降低，可能是由于随着高盐胁迫时间的延长，辣椒植株的生长发育受到影响，进而导致 其 基 因 表 达 水 平 的 降 低。干 旱 处 理 下，以相对较高的强度表达，每组处理均显示出显著的上调，在处理时，表达量达到峰值，为对照组的 倍，之后虽有所下降，但一直维期刁玄章，等：辣椒 基因克隆及胁迫下的表达分析持一个较高的表达水平。由于在干旱胁迫处理下 基 因 具 有 高 表 达 水 平，本 研 究 推 测 可以被干旱胁迫应激诱导。在抗高温胁迫方面，有研究人员发现从高温处理的柑橘中鉴定出个基因的表达水平发生变化，推测它们参与了抗高温逆境的过程。基因在 高温胁迫处理 时表达量达峰值，为对照的 倍。本研究结果表明高温、干旱、盐害等非生物胁迫均能诱导 的表达。在生物胁迫应答过程中的功能研究比非生物胁迫应答功能的研究更加透彻。在水稻中，被 细 菌 病 原 菌 诱 导 表 达，研 究 发 现，超 表 达 转基因植株对病原菌 抵抗力明显增强，与抗病性相关联的基因 、的表达水平也显著提高，推测 基因对水稻的抗病害调控是在转录水平上实现。本研究发现辣椒 同样受到生物胁迫诱导。辣椒幼苗在接种辣椒疫霉菌后，基因的相对表达水平显著上调，总体呈现出倒型的趋势。处理、和 后表达量与对照组相比增幅较大，在 时，相对表达量达到峰值，为对照组的 倍。本项目组在前期研究中从辣椒基因组共鉴定出 个 基因。在调节耐热胁迫和青枯菌感染方面发挥了重要作用。王育娜等 从辣椒 文库克隆得到了个 类转录因子，参与了各种生物与非生物胁迫；主要介导了抗病反应；主要受疫霉的诱导表达；而 则参与了植株损伤的调控。辣椒基因还被证明显示出一 定 的 组 织 特 异 性 和 诱 导 表 达 模 式 。、和 分别在青枯雷尔氏菌、辣椒青霉菌和接种下显示诱导的表达模式。和 过表达分别对青枯 雷尔 氏 菌 感 染 的抗性产 生 正 向 和 负 向 调节 。结 合 以 上 这 些 结 果，本 研 究 推 测 可能同样是对胁迫反应的调节因子。相信随着基因组学、蛋白质组学和分子生物学等学科的发展，辣椒中将会有越来越多的 转录因子的功能被揭示。参考文献：，（）：，（）：，（）：肖翔辣椒一个新的 转录因子的克隆及其功能初步分析福州：福建农林大学，（）：，（）：江腾，林勇祥，刘雪，等苜蓿全基因组 转录因子基因的分析草业学报，（）：，（）：，：，（）：许瑞瑞，张世忠，曹慧，等苹果 转录因子家族基因生物信息学分析园艺学报，（）：，（）：邹智蓖麻 转录因子的全基因组鉴定及其进化分析中国油料作物学报，（）：，（）：，西北植物学报 卷 ，（）：，（）：，（）：，：，：，（）：，（）：，（）：，（）：李淑敏，茆振川，李蕾，等辣椒抗根结线虫相关 基因的分离园艺学报，（）：，（）：王育娜，贺俐，曹蕾，等辣椒推定 基因