基于网络药理学和实验验证探...治疗缺血性脑卒中的作用机制_蒲馨颖.pdf

世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.药物研究：基金项目：山东省中医药科技项目（）；淄博市重点研发计划项目（）；第五批全国中医临床优秀人才研修项目（国中医药人教函 号）作者单位：山东中医药大学 级硕士研究生，山东 济南；山东中医药大学康复医学院，山东 济南；山东中医药大学 级硕士研究生，山东 济南；山东中医药大学 级硕士研究生，山东 济南；山东淄博市中医医院脑病科，山东 淄博 通信作者：朱文浩，：基于网络药理学和实验验证探讨熄风清火活血化痰方治疗缺血性脑卒中的作用机制蒲馨颖 英振昊 郭大千 门伟业 朱文浩【摘要】目的 基于网络药理学方法探讨熄风清火活血化痰方治疗缺血性脑卒中（，）潜在的作用机制，并对其潜在的功能靶点进行实验验证。方法 采用 平台、平台、平台、文献筛选熄风清火活血化痰方中各中药的活性成分，利用 靶点预测模型、数据库预测活性成分的潜在靶点；利用、数据库检索缺血性卒中的相关靶点并筛选得到疾病靶点，取疾病靶点与药物靶点的交集，利用 对药物与疾病的交集靶点进行蛋白质相互作用网络进行构建，通过 软件进行拓扑分析获得熄风清火活血化痰方治疗缺血性卒中的关键靶点；利用 对关键靶点进行 和 富集分析。通过 检测对网络药理学的富集分析结果进行验证。结果 共得到有效成分 个，药物靶点 个，筛选缺血性脑卒中靶点 个，最终获得关键靶点 个，通路富集分析筛选得到前 条信号通路。熄风清火活血化痰方治疗缺血性卒中主要成分为槲皮素、山奈酚、谷甾醇、木樨草素、豆甾醇等，关键靶点、等。关键的信号通路可能包括 信号通路、流体剪切力与动脉粥样硬化信号通路、信号通路、信号通路、信号通路等。检测结果表明，与空白组比较，模型组 、表达升高，差异有统计学意义（），与模型组比较，中药组 、表达降低，表达升高，差异有统计学意义（）。结论 揭示了熄风清火活血化痰方多成分、多靶点、多途径治疗缺血性卒中的机制，初步证实了该方对靶点蛋白、表达的影响，为熄风清火活血化痰方的临床开发利用提供了依据。【关键词】网络药理学；熄风清火活血化痰方；缺血性脑卒中【中图分类号】【文献标识码】，（，；，；，；，；，）【】（），世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.，（），（），【】；近年来缺血性脑卒中在我国的发病率、患病率持续上升，致残率、病死率居高不下。至 年，缺血性脑卒中的发病率约为出血性脑卒中的 倍。脑卒中急性期病情进展迅速，其治疗对疾病的预后有至关重要的影响。现代医学在该方面已取得显著进展，如静脉溶栓、血管内介入取栓、抗血小板治疗等。但目前仍然面临溶栓率低、复发率高、生活质量下降、经济负担持续升高、卒中后情感障碍等问题，。我们有必要进一步探索更多有效的治疗药物，制定更加完善的防治对策。中药复方具有多成分、多靶点治疗疾病的优势，在治疗急性期缺血性脑卒中方面具有广阔的前景。前期研究结果显示，缺血性脑卒中急性期的主要证候要素是内风、内火、痰湿、瘀血。我们根据此病机理论，研制熄风清火活血化痰方治疗，临床上取得了确切疗效。但由于中药复方成分复杂、靶点复杂，该方的作用机制尚不明确。网络药理学以生物网络数据库为基础，构建生物网络并进行可视化，揭示中药、化合物、靶点、疾病之间的网络关系，以预测药物的药理学机制。为进一步明确熄风清火活血化痰方的作用机制，对本方进行网络药理学分析。资料与方法 熄风清火活血化痰方活性成分的筛选和靶点预测熄风清火活血化痰方由 味中药组成，分别是天麻、钩藤、石决明、龙骨、牡蛎、黄芩、栀子、丹参、赤芍、红花、牡丹皮、川芎、白附子、胆南星、石菖蒲、全蝎、蜈蚣组成。选取 数据库收集以上 味中药的化学成分，筛选活性成分条件为口服生物利用度（，）、类药性（，），运用 的靶点预测模型对重要的活性成分的作用靶点进行预测。在 中 未 找 到 有 效 成 分 的 中 药，在或 或 或文献中查找并筛选其有效成分。并在小分子生物活性数据库 （：）中找到这些有效成分的 结构式，输入到 数据库（：）、数据库（：）、数据库（：），在数据库中进行靶点预测，利用同样的方法补充在 中未预测到的作用靶点，并对结果进行整合。利用（：）数据库将所得靶点进行统一规范。构建“中药 活性成分 靶点”网络使用软件 构建熄风清火活血化痰方的“中药 活性成分 靶点”网络，其中用“节点”（）表示成分和靶点，用“边”（）表示二者的关系；使用 分析工具分析网络的特征，包括连接度（）、介度（）及紧密度（）等，以研究活性成分与靶点之间的关系。缺血性脑卒中相关靶点检索及熄风清火活血化痰方治疗缺血性脑卒中的潜在靶点的获得利用“”为 关 键 词 在、等疾病基因数据库进行检索与筛选将结果合并后删除重复值，并利用 数据库将所得靶点进行统一规范。将药物潜在靶点与疾病靶点取得交集，获得熄风清火活血化痰方治疗缺血性脑卒中的潜在靶点，并利用韦恩图将交集情况可视化。蛋白质互相作用网络构建及关键靶点筛选将获得的熄风清火活血化痰方治疗缺血性脑 世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.卒中的潜在靶点输入 数据库（：）进行检索，设置蛋白种类为“”，最低相互作用阈值为 ，构建蛋白相互作用的 网络。将熄风清火活血化痰方治疗缺血性脑卒中的潜在靶点导入 内，生成 个 网络，利用 对该网络进行拓扑分析，通过各个节点的 值进行筛选，从而得到关键靶点。通路富集分析将筛选后的靶点导入 平台（：）进行 及 分析，保存其结果并通过微生信软件进行可视化。从中选取排名靠前的核心靶点进行分析。动 物 级雄性 大鼠共 只，体质量 ，动物合格证号：，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证：（京）。饲养于山东中医药大学教育部重点实验室。实验前先进行适应性饲养 周，温度 ，相对湿 ，自由饮水及进食。药 物熄风清火活血化痰方，方药组成：天麻 ，钩藤（后下），石决明，龙骨，牡蛎，丹皮，丹参，赤芍，川芎，红花 ，白附子，石菖蒲 ，胆南星 ，栀子 ，黄芩，全蝎，蜈蚣。以上中药均购自本院中药房。饮片按照常规方法用水煎煮 次，混匀后用双层纱布过滤，收集滤液，文火煎煮浓缩成 生药，分装灭菌后 冰箱内保存备用。试 剂 抗体（，）、抗体（，）、抗体（，）、抗体（，）、抗体（，）；抗体（，），抗体（，），抗体（，），抗体（，）。仪 器 高速冷冻离心机（公司）；电泳槽（公司）；转膜槽（公司）；全自动化学发光 荧光图像分析系统（上海天能科技有限公司）；型电泳仪电源（北京六一生物科技有限公司）；摇床（美国 公司）；微孔板分光光度计（酶标仪）（美国伯腾仪器有限公司）；电子天平（德国 公司）；纯水机（威立雅水处理技术公司）。动物分组及造模将 只 大鼠按体质量随机分为 组，空白对照组、模型组、中药组，每组各 只。将模型组、中药组制作 模型。具体方法：大鼠腹腔注射水合氯醛（）麻醉。大鼠仰卧于手术台上，经颈正中切口显露右侧颈总动脉（，）、颈内动脉（，）和颈外动脉（，）。头端直径为（）的尼龙线从右侧 进入右侧，直到超出 分叉 。结扎血管，切断多余的尼龙线。缝合切口后，局部滴注 布比卡因以减轻术后疼痛。在整个手术过程中，使用加热垫检测并维持大鼠肛门温度（）。侧卧位放置大鼠等待苏醒。采用 分制评分标准评价神经功能缺损程度。分：无神经功能缺损；分：轻度局灶性神经功能缺损（右前爪不能完全伸展）；分：中度局灶性神经功能缺损（向右侧转圈）；分：重度局灶性神经功能缺损（向右侧倾倒）；分：不能自主行走，意识水平下降。以分值 分作为造模成功的入组标准。造模插线操作超过 、术中出血多、麻醉过深呼吸不规律、术后 仍不能苏醒的动物不列入统计范围。给药及取材空白 组、模 型 组 每 只 大 鼠 给 予 生 理 盐 水 （）；中 药 组 每 只 大 鼠 给 予 中 药 （），早晚各 次。第 天取材。第 天灌胃 后取材。模型组、中药组取病灶侧大脑组织，空白组取相对应部位脑组织。先用液氮冷冻，再用 冰箱保存。检测取脑组织，加入 裂解液，低温条件下匀浆，以离心半径 ，转速离心 提取蛋白，法测定蛋白浓度。经 聚丙烯酰胺凝胶电泳后将电泳产物转移至 膜上，脱脂奶粉 封闭，一抗（、均 稀释）孵育，二抗（）稀释）孵育，发光，显影，定影。先检测磷酸化抗体，洗膜世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.注：圆形代表中药；八边形代表化合物；四边形代表药物靶点图 中药 化合物 靶点网络图后检测非磷酸化抗体，再次洗膜后检测 。扫描仪扫描后，用 计算灰度值。统计学方法采用 统计学软件分析数据，实验数据以均数 标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，以 .表示差异有统计学意义。结 果 熄风清火活血化痰方活性成分及靶点获取获得有效成分 个，删除重复后为 个。得到靶点 个，利用 进行统一规范，删除重复后为 个。中药化学成分数据来源及靶点。结果见表。熄风清火活血化痰方“中药 活性成分 靶点”网络的构建和分析借助 对熄风清火活血化痰方的活性成分及其作用靶点的关系网络进行绘制与分表 中药有效化学成分数据来源及靶点统计表 文献成分靶点天麻钩藤石决明龙骨牡蛎栀子黄芩牡丹皮丹参赤芍川芎红花白附子石菖蒲胆南星全蝎蜈蚣合计（去重）注：“”表明该中药的有效成分来源于该数据库或文献析，共获得 个节点（包含中药 个，活性成分 个，潜在靶点 个），条关系的中药 化 世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.合物 靶点网络。结果见图。对该网络进行拓扑分析，值前 的化合物为槲皮素（）、山奈酚（）、谷固醇（）、木樨草素（）、豆固醇（），推测可能为熄风清火活血化痰方的重要成分。缺血性脑卒中相关靶点的检索在、数 据 库 中 输 入“”，分别得到 个、个（经筛选后得到 个）、个（经筛选后得到 个）缺血性脑卒中疾病靶点，去除重复后得到 个靶点。药物靶点与疾病靶点的交集为 个，交集图见图。图 熄风清火活血化痰方与缺血性脑卒中靶点韦恩图 熄风清火活血化痰方治疗缺血性脑卒中的 网络构建与关键靶点筛选借助 软件构建熄风清火活血化痰方治疗缺血性脑卒中的潜在靶点的 网络，去除游离节点后，得到一个 个节点、条边的 网络。计算该 网络的拓扑学特征属性值，节点 值的中位数是，该值 的节点有 个。筛选 倍 值中位数的靶点，共获得 个关键靶点。排名最为靠前的靶点分别是、。推测为熄风清火活血化痰方治疗缺血性脑卒中的核心靶点。核心靶点的筛选策略图见图。熄风清火活血化痰方治疗缺血性脑卒中通路富集分析可视化利用 平台对上述 个关键节点进行基因富集分析，包括 的（，生物过程）、（，细胞组分）、（，分子功能），分别将 值（靶点数量）排名前 的结果进行可视化，结果见图。对 个关键节点进行 富集分析，将其 值排名前 的结果进行可视化，结果见图。熄风清火活血化痰方对、表达的影响通过网络药理学分析预测，、是熄风清火活血化痰方治疗缺血性脑卒中的重要靶点。方法检测相应指标，验证预测的结果。研究结果表明，与空白组比较，模型组 、升高，差异有统计学意义（）；与模型组比较，中药组 、降低，升高，差异有统计学意义（）。结果见图。注：左侧 图为熄风清火活血化痰方治疗缺血性脑卒中的 个潜在靶点；右侧 图为 值 的核心靶点图 核心靶点筛选策略图世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.注：横轴代表靶点数量；纵轴代表 类型；深蓝色代表生物过程；浅蓝色代表细胞组分；橙色代表分子功能图 熄风清火活血化痰方治疗缺血性脑卒中的 富集分析条形图 注：轴为富集通路的名称，轴代表该条通路上基因的数目与 个关键靶点的比值（）；气泡颜色由红到绿代表 值从小到大，气泡面积由大到小代表该通路的基因计数由多到少图 熄风清火活血化痰方治疗缺血性脑卒中的 富集分析气泡图 讨 论根据拓扑分析结果推测，熄风清火活血化痰方治疗缺血性脑卒中的主要成分可能为槲皮素、山奈酚、谷甾醇、木樨草素、豆甾醇等。槲皮素、山奈酚、木樨草素、黄芩苷均为黄酮类化合物，具有广泛且相似的生物功能，如抗炎、抗氧化等。谷甾醇和豆甾醇均属于植物甾醇，均可通过清除羟自由基和超阳离子防止脂质过氧化，减轻神经细胞氧化损伤，且能减轻神经炎症反应及功能损伤，。许多化学成分被证实在 的治疗方面具有重要意图 各组