假臭草来源植物内生真菌生物转化(+)-柠檬烯产物分析_杨道茂.pdf

第 卷第期华 侨 大 学 学 报（自 然 科 学 版）年月 （）：假臭草来源植物内生真菌生物转化（）柠檬烯产物分析杨道茂（华侨大学 化工学院，福建 厦门 ）摘要：为了筛选能够生物转化（）柠檬烯的微生物，将株假臭草内生真菌作为生物催化剂，在，下发酵后，添加体积分数为 的（）柠檬烯继续转化，并采用薄层层析、气相色谱质谱联用和核磁共振技术分析产物结果表明：各真菌生物转化（）柠檬烯的主要产物为（，）柠檬烯，二醇、环氧柠檬烯、（，）柠檬烯，二醇等；菌株 生成唯一产物（，）柠檬烯，二醇，质量浓度达到（）关键词：（）柠檬烯；假臭草；植物内生真菌；（，）柠檬烯，二醇中图分类号：文献标志码：文章编号：（）（）（，）：（），（），（）（，），（，），（，），（）：（）；（，），（）柠檬烯为柠檬精油的主要成分，属于柑橘加工过程中的副产物由于结构简单、价格低廉，有多个可以催化的位点，（）柠檬烯一直是理想的生物转化底物模型 能转化（）柠檬烯的微生物种类多样，如假单胞属细菌（），尖孢镰刀菌 、指状青霉菌、黑曲霉、解脂耶氏酵母 虽然在生物催化剂的筛选领域取得了巨大的进展，但微生物的低转化效率 和巨大的筛选工作量严重影响生物转化的推广与应用，如 等 从 株菌株中只发现株菌株能够转化（）柠檬烯 针对该问题，有学者指出植物内生真菌是一个很有发展前景的筛选来源植物内生真收稿日期：通信作者：杨道茂（），男，讲师，博士，主要从事微生物生物转化的研究 ：基金项目：国家级大学生科创项目（）；福建省个人和团队科技员项目（年度）；华侨大学高层次人才科研启动资金资助项目（）：菌因为需要与宿主植物一起共进化来适应环境的变化，使其可能会产生丰富的酶来适应宿主，如海藻来源内生真菌 能将外消旋樟脑转化为 羟基樟脑、羟基樟脑等产物，火炬松来源内生真菌 能转化（）柠檬烯合成香芹酮和柠檬烯，二醇，如果底物为柑橘皮提取物，则生成单一产物柠檬烯，二醇，内生真菌 能转化硫利达嗪 因此，利用植物内生真菌进行生物转化是可行的 假臭草（）属于菊科植物，原产南美，现入侵亚洲和大洋州等地 由于假臭草对土壤肥力吸收力强，严重影响果树的生长，此外，它能分泌一种有毒的恶臭味，影响家畜觅食，属于入侵植物 研究发现假臭草花精油对柑橘木虱具有驱避和致死活性，且其总黄酮类化合物对金黄葡萄球菌有抑菌活性 目前，尚未见到假臭草内生真菌用于生物转化（）柠檬烯的相关报道 基于此，本文以分离自假臭草内生真菌为生物转化剂，考察其生物转化产物材料与方法 药品与仪器（）柠檬烯（日本东京化成工业株式会社）；石油醚（）、无水乙醇、乙酸乙酯（上海市国药试剂有 限 公 司）；（，）（）二 戊 烯，二 醇（，）柠 檬 烯，二 醇，号：，美国 公司）；氘代甲醇（广东省广州赛迪菲生物科技有限公司）以上试剂均为分析纯 滤膜（天津市津腾实验设备有限公司）；目硅胶、型薄层层析硅胶板（，山东省青岛海洋化工厂分厂）型振荡培养箱（上海支楚仪器有限公司）；型旋涡混合器（江苏省金坛市白塔新宝仪器厂）；型洁净工作台（江苏省苏州安泰空气技术有限公司）；型医用离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；型气质联用仪器（带 自动进样器，美国安捷伦科技有限公司）；型旋转蒸发仪（日本东京理化器械株式会社）；型核磁共振谱仪（瑞士布鲁克公司，由华侨大学分析测试中心提供）微生物与培养基株植物内生真菌（，）由华侨大学化工学院王奇志博士馈赠培养基均采用沙保氏培养基：蛋白胨，葡萄糖（值为 ）检测方法薄层层析（）方法：展开剂为（石油醚）:（乙酸乙酯）:，显色剂采用体积分数为的香草醛浓硫酸溶液气相色谱质谱联用（）：型色谱柱（），载气为氦气，进样量为温度程序：保持 ，升温到 ，保持 离子源温度为 ，四极杆温度为 ，质谱扫描范围（）为 实验步骤 菌株活化与发酵各测试菌株接种于装有马铃薯葡萄糖琼脂培养基的培养皿（直径为）上，在 恒温培养箱中培养后，存于冰箱中备用 每株菌挑取一接种环菌丝接种于装有 培养基的 锥形瓶中，在，条件下培养 生物转化（）柠檬烯及产物分析生物转化流程参考海洋真菌的生物转化流程并做细微调整，具体流程为：在每株菌培养了的 发酵液中，加入 经 滤膜过滤除菌的（）柠檬烯乙醇溶液（柠檬烯溶于等体积乙醇，柠檬烯的最终体积分数为），在，条件下继续培养 华 侨 大 学 学 报（自 然 科 学 版）年 ：转化结束，发酵液用布氏漏斗过滤后，取 滤液转移到 的试管中，用等体积乙酸乙酯萃取；然后，将萃取相转移到干燥的 的试管中，并用无水硫酸钠脱水；最后，取萃取相进行 和 检测 菌株 转化产物结构鉴定鉴于 检测结果，选取包含个转化产物的菌株 ，按照节 的生物转化流程制备转化产物 具体流程为：配制 发酵培养基，分装于 瓶 锥形瓶中 后续的发酵与转化步骤参考节，转化结束，将发酵液用布氏漏斗过滤，等体积乙酸乙酯萃取滤液次后，合并萃取液，用旋转蒸发仪于，真空度 下蒸发有机溶剂，最终获得转化产物 取少量乙酸乙酯完全溶解转化产物后，用 目硅胶拌样阴干，随后采用干法上玻璃色谱柱（），洗脱剂体系采用（石油醚）:（乙酸乙酯）为:进行洗脱，每个梯度洗脱体积为 以上，并用 跟踪洗脱结果最终获得化合物 （），（），用氘代甲醇溶解后进行核磁共振检测 各菌株转化产物的质量浓度检测建立柠檬烯，二醇标准曲线实验步骤为：用乙酸乙酯溶解标准品并配制 母液，采用逐步稀释的方法，将母液稀释成不同质量浓度，随后采用节 的方法获得柠檬烯，二醇的峰面积质量浓度的关系图挑取各菌株的菌丝接种于装有 培养基的 锥形瓶中，每株菌重复次，后续发酵和图各真菌萃取相 图 生物转化步骤参考节，最后，依据标准曲线求出各菌株转化产物的平均质量浓度实验结果与讨论 各菌萃取液 分析将各真菌的萃取相进行 检测，结果如图所示 由图可知：菌株 ，和 的条带仅发现个主要斑点，且比移值（）与标准品（，）柠檬烯，二醇）一致；菌株 ，的条带明显多出个斑点从真菌测序结果可知，除了菌株 归属于扁桃腐皮壳菌（.），其余菌株归属于链格孢属（.），但转化产物却不相同，（）菌株 说明转化产物与种属之间不存在必然的联系 转化产物 检测各菌株转化产物总离子色谱（）图，如图所示图中：为强度；为时间 检索 数据库可知，峰匹配环氧柠檬烯（），属于柠檬烯，二醇前体物质 ；峰匹配化合物柠檬烯，二醇，保留时间与标准品一致；峰匹配结果与峰一致，推测为峰的同分异构体；峰未检索到匹配的化合物（）菌株 （）菌株 （）菌株 第期杨道茂：假臭草来源植物内生真菌生物转化（）柠檬烯产物分析 ：（）菌株 （）菌株 （）菌株 图各菌株转化产物的 图 转化产物结构鉴定化合物 ，的 图和 图，如图所示（）图（）化合物 的 图（）化合物 的 图图化合物 ，的 图和 图 ，经数据库检索，化合物 ，均匹配为柠檬烯，二醇，结合 结果，推测二者为同分异构体化合物 碳谱 （，）的化学位移（）为 ，该碳谱化学位移与文献报道的化合物（，）柠檬烯，二醇）完全一致，也与化合物 的碳谱化学位移相同 化合物 的氢谱 （，）的化学位移（）为 （，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，）该数据与化合物的氢谱数据一致 综上，化合物 归属于（，）柠檬烯，二醇 化合物 和化合物的碳谱图和氢谱图，如图所示（）化合物 （）化合物图化合物 和化合物的碳谱图和氢谱图 化合物 碳谱 （，）的化学位移（）为 ，该碳谱数据与化合物（，）柠檬烯，二醇）数据华 侨 大 学 学 报（自 然 科 学 版）年 ：完全相同 化合物 的氢谱 （，）的化学位移（）为 （，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），（，），该数据与化合物的氢谱数据一致 综上，归属为（，）柠檬烯，二醇 与化合物的碳谱图和氢谱图，如图所示（）化合物 （）化合物图化合物 和化合物的碳谱图和氢谱图 由图，可知：较高的斑点为（，）柠檬烯，二醇，较低的斑点为（，）柠檬烯，二醇文献 报道柠檬烯转化为柠檬烯，二醇时，需要通过 结合单加氧酶（）生成柠檬烯环氧化物（，），再通过环氧化物水解酶（）生成柠檬烯，二醇 通过比较株植物内生真菌的转化产物，可得以下个结论）来源于不同种属植物内生真菌的环氧化物水解酶存在差异，如.和.，前者生成（，）柠檬烯，二醇，后者额外生成（，）柠檬烯，二醇，与文献 报道的氯过氧化物酶转化（）柠檬烯生成柠檬烯，二醇类似，该酶在氯离子存在下生成种手性产物）即使是来源于同一种属植物内生真菌的环氧化物水解酶也可能存在差异，如.与.生成（，）柠檬烯，二醇，而.，.和.则额外生成（，）柠檬烯，二醇因此，该转化机制可能需要进一步完善 产物的测量柠檬烯，二醇标准曲线，如图所示图中：为峰面积；为柠檬烯，二醇的质量浓度由图可得标准曲线方程为 .，依此标准曲线，各菌株产（，）柠檬烯，二醇的质量浓度，如图所示图柠檬烯，二醇标准曲线 图各菌株产（，）柠檬烯，二醇的质量浓度 ，（，），由图可知：各菌株产（，）柠檬烯，二醇的质量浓度为 其中，菌株 产量最高，达到（），实验结果与文献 吻合第期杨道茂：假臭草来源植物内生真菌生物转化（）柠檬烯产物分析 ：结束语转化产物柠檬烯，二醇（柠檬甘油）属于一种比较重要的柠檬烯含氧衍生物 研究表明，该化合物具有抗癌 和抗炎活性，也可作为合成其他生物活性物质前体 由于该化合物存在种立体构型，手性不同的纯萜类对映体其药理活性（抗微生物活性、毒性或气味特性）存在差异，如（，）柠檬烯，二醇和（，）柠檬烯，二醇对新生隐球菌（）的最小抑制浓度分别为 ，因此，种构型的化合物生物活性数据有待进一步挖掘采用假臭草来源植物内生真菌转化（）柠檬烯，转化单一且产量达克级，转化效果较理想参考文献：台亚楠，董曼，任婧楠，等柠檬烯微生物转化的研究进展食品科学，（）：，（）：，（）：，（）（），（）：，（）（）（）（）：，（）：（），（）（）（）（），（）：，（）：，（），（）：，（）：，（）（），（）：，（）（），（）：，：，（）：，（）：，（）：华 侨 大 学 学 报（自 然 科 学 版）年 ：，（）：，（）：（）王奇志，刘育梅，李书明，等假臭草花精油的化学组成及对柑橘木虱的驱避和致死活性昆虫知识，（）：王伟，代光明，李书明，等假臭草总黄酮超声波辅助提取工艺优化及抑菌活性天然产物研究与开发，（）：杨道茂，陈煌 近海海洋真菌生物转化（）柠檬烯 华侨大学学报（自然科学版），（）：，：，（）：张璐璐，范刚，何进，等 柠檬烯微生物转化及其相关酶的研究进展 食品工业科技，（）：，：，（）：，：，（），：，（），（）：，（）：，（）：，（）（），（）：，（，）（，），：，（）：，（）：，（）：，（）：（责任编辑：钱筠英文审校：刘源岗）第期杨道茂：假臭草来源植物内生真菌生物转化（）柠檬烯产物分析