基于原子力显微镜研究黄原胶...子结构的云母片处理方法优化_唐翠娥.pdf

唐翠娥，周培源，刘延照，等.基于原子力显微镜研究黄原胶分子结构的云母片处理方法优化 J.食品工业科技，2023，44（14）：6066.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022080260TANG Cuie,ZHOU Peiyuan,LIU Yanzhao,et al.Optimization of Mica Processing Method Based on Atomic Force Microscopy toStudy the Molecular Structure of Xanthan GumJ.Science and Technology of Food Industry,2023,44(14):6066.(in Chinese withEnglish abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022080260 研究与探讨 基于原子力显微镜研究黄原胶分子结构的云母片处理方法优化基于原子力显微镜研究黄原胶分子结构的云母片处理方法优化唐翠娥，周培源，刘延照，李艳*（华中农业大学食品科学与技术学院，湖北武汉 430070）摘要：原子力显微镜（Atomic Force Microscopy，AFM）成像常用于研究多糖分子结构，然而针对阴离子多糖，现有的制样方法较难在小范围观察区获得其清晰的单分子束结构图片。因此，本文以黄原胶为阴离子多糖代表，从不改变多糖本身结构、提升成像质量角度出发，对多糖样品浓度，云母片不同金属离子盐种类、浓度和处理时间等 AFM 制样方法进行了优化。结果表明，在空白云母片上，黄原胶浓度 15 g/mL 时可观测到多糖单分子束结构，但在 15 m15 m 扫描范围内可观测的分子束较少。通过对云母片进行处理优化，最佳处理条件选定在0.5 mmol/L 的 CaCl2溶液处理 2 min 或 2 mmol/L CaCl2溶液处理 0.5 min。在此条件下，当黄原胶浓度为 5 g/mL时，在 3 m3 m 观测范围内，处理后云母片上的黄原胶分子束数量及成像质量相比空白云母片显著提升，且其单分子束高度与分子结构并未发生改变。此外，通过提高云母片干燥温度可以获取更均匀的黄原胶分子结构图片。本研究可为其他阴离子多糖 AFM 成像的样品制备提供可借鉴的方法参考。关键词：黄原胶，原子力显微镜(AFM)，多糖分子束，成像，制样方法本文网刊:中图分类号：Q539+.8 文献标识码：A 文章编号：10020306（2023）14006007DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022080260OptimizationofMicaProcessingMethodBasedonAtomicForceMicroscopytoStudytheMolecularStructureofXanthanGumTANGCuie，ZHOUPeiyuan，LIUYanzhao，LIYan*（College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China）Abstract：Atomic Force Microscopy imaging is generally used for investigating the molecular structure of polysaccharides.However,for ionic polysaccharides,it is still difficult to obtain clear images with monolayer structure under the limitedobservation region based on the reported sample treatment methods.Taking xanthan gum as the typical ionicpolysaccharide,in order to improve the image quality without changing the structure of polysaccharide,the samplepreparation procedures were optimized,including sample concentration,variety and concentration of salt ions,andtreatment time.The results showed that monolayer structure of xanthan was observed on clear mica when xanthanconcentration was 15 g/mL.However,the observed monolayer structure became much less when the observation regionwas 15 m15 m.Then,the mica was treated and the treatment conditions were optimized.The optimized treatmentconditions were selected as 2 min treatment by using 0.5 mmol/L calcium chloride solution or 0.5 min treatment by using2 mmol/L calcium chloride solution.Under this condition,the molecular structure of 5 g/mL xanthan gum was observed.The results illustrated that the number of monolayer xanthan gum molecular chains greatly increased within the observationregion of 3 m3 m,as compared with that on the untreated mica.Meanwhile,the treatment of mica could keep the heightand morphology of monolayer structure of xanthan gum.In addition,the images of monolayer structure with more 收稿日期：20220824 基金项目：国家自然科学基金面上项目（31972976）。作者简介：唐翠娥（1983），女，博士，实验师，研究方向：天然产物化学，E-mail：。*通信作者：李艳（1983），女，博士，教授，研究方向：胶体与界面科学，E-mail：。第 44 卷 第 14 期食品工业科技Vol.44 No.142023 年 7 月Science and Technology of Food IndustryJul.2023 homogenous distribution could be obtained by increasing the drying temperature for mica.This study could provide anexperimental reference for the sample preparation of other anionic polysaccharide in AFM imaging.Keywords：xanthan gum；Atomic Force Microscopy(AFM)；polysaccharide molecular layer；imaging；sample preparation 多糖是一类具有复杂结构的生物聚合物，在细胞识别、信号转导和生物发育等方面发挥着重要的生理作用12。同时因具有良好的增稠、乳化、稳定和凝胶的应用特性，被广泛应用于食品、化妆品、畜禽养殖和制药等领域37。研究表明，多糖的理化特性和生物活性往往与其结构具有紧密的联系，以往的多糖结构研究主要集中在分子链的单糖组成和糖苷键的连接方式等基础理论研究，而表征多糖的分子链形态和空间结构形成才是探究多糖高级结构与性质之间关系的重要依据8。因此寻求直观可靠的表征手段对多糖分子束空间结构进行探究，对阐明多糖性质，进而扩宽应用领域具有重要意义9。原子力显微镜（Atomic Force Microscopy,AFM）是近十几年发展起来的研究生物大分子形态和构象的强大显微镜技术，是目前获取多糖结构信息最通用的检测技术之一，具有纳米级分辨率1011。与其他显微技术相比，AFM 技术的样品制备相对简单，同时成像过程中免去了真空条件和重金属染色对样品的破坏，能以最小的损伤呈现样品的原始状态提高代表性12。由此，AFM 技术被广泛用于多糖的结构表征中，如聚糖、黄原胶、卡拉胶、木葡聚糖、果胶、阿拉伯木聚糖、裂叶聚糖、淀粉等13。然而，AFM 成像分析中，为保持多糖样品的原始状态，对制样环境和操作手法要求较高。已报道的多糖样品制备方法都是参考性质相似，甚至不相似的样品，不具有针对性11,13。多糖分子结构的观察多采用轻敲模式，并使用亲水性较高的云母片作为样品衬底，但是新鲜剥开的云母表面会立即带负电荷，阴离子多糖沉积在刚切割的云母上时，由于负电互斥而固定不足，导致观察视野内多糖分子链数量不足，成像效果差1415。因此，正确的制样处理方法研究对多糖后续的 AFM 成像至关重要。多糖 AFM 分析中，采用合适的方法将多糖分子吸附到基底上是实现理想分子状态的一个关键因素，而样品的浓度、样品表面的水层、多糖的溶剂、在云母片表面沉积的加样方法等也是影响成像重要的因素14,16。对于多糖 AFM 成像，测试样品的浓度通常在 0.110 g/mL，单分子或者分子的分散情况则通过进一步稀释实现。此外，吸附在多糖和云母上的水层能够维持多糖的结构，过厚则容易降低 AFM 的分辨率，而使用温和方法如改变多糖沉积时云母片的温度，从云母片中蒸发掉多余的水，能够保持多糖初始生理结构1011,13。阴离子多糖则通过添加带电离子钙盐和镁盐、一些化学药剂与表面活性剂等改变云母表面带电情况实现多糖链的固定和沉积11,17。但此方法通常需要进一步优化，如邵丽等10将云母片使用 20 mmol/L 的 Mg2+处理 2 min 后观测 10 ng/mL阴离子胞外多糖结构，发现在如此低的多糖浓度下，其 AFM 成像仍然发生了聚集。可见，云母片离子处理（包括离子类型、处理浓度、处理时间）与多糖浓度之间的关系对多糖 AFM 原始生理结构成像存在较大的影响。因此，通过多因素条件优化和处理方法改善，获得普适性更高的基本技术和关键因素，可以提高原子力显微镜在阴离子多糖结构中的应用质量。自然界中，天然存在的仅甲壳素为碱性多糖，大多为酸性多糖即阴离子多糖18。如黄原胶（Xanthangum，XG）是以玉米淀粉、蔗糖等为主要原料在甘蓝黑腐病野油菜黄单胞菌发酵产生的一种高黏度水溶性胞外酸性杂多糖1920。本实验选择黄原胶为阴离子多糖代表，从不改变多糖本身结构性质角度出发，通过改变多糖样品浓度，云母片不同金属离子盐种类、盐处理浓度和处理时间进行云母片表面带电处理，改变云母片处理温度对多糖 AFM 成像样品制备方法进行优化，以期为其他阴离子多糖的 AFM 成像样品制备提供可借鉴的方法参考。1材料与方法 1.1材料与仪器黄原胶（美国药典级）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；CaCl2、MgCl2、ZnCl2、AlCl3均为分析纯国药集团化学试剂有限公司；RTESP-300 探针美国布鲁克仪器有限公司；云母片海德创业（北京）生物科技有限公