抗体类药物非聚糖翻译后修饰的LC-MS表征分析_俞海东.pdf

第35卷 第6期2023年6月Vol.35,No.6Jun.,2023生命科学Chinese Bulletin of Life Sciences文章编号：1004-0374(2023)06-0769-10DOI:10.13376/j.cbls/2023087收稿日期：2022-10-31；修回日期：2023-01-20基金项目：国家重点研发计划项目(2022YFC2009600)*通信作者：E-mail:抗体类药物非聚糖翻译后修饰的LC-MS表征分析俞海东3，石莲花1，金有训1*，韩荣勋2(1 中国计量科学研究院，北京 102200；2 长江大学动物科学学院，荆州 434025；3 上海中侨职业技术大学，上海 201514)摘要：抗体类药物往往存在复杂多样的翻译后修饰(post-translational modifications,PTMs)，由此产生高度的异质性。PTMs 表征是抗体类药物研发的重要组成部分。尤其在早期研发阶段，高质量的结构表征可以为药物筛选、药物发现、工艺开发和优化提供指引和依据。基于液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术的表征分析手段可快速、准确地识别 PTMs，已成为抗体类药物 PTMs 分析及结构表征的有力工具。该文综述了抗体类药物非聚糖 PTMs 的鉴定成果，内容包括修饰类型、修饰位点、修饰所在区域、表达系统信息及潜在影响，并对 LC-MS 表征分析策略进行了一定的探讨，希望为抗体类药物早期研发阶段的表征分析提供参考。综述的非聚糖 PTMs 均通过 LC-MS 或 LC-MS/MS 技术得到了鉴定。关键词：抗体类药物；LC-MS；表征；翻译后修饰中图分类号：O657；Q53 文献标志码：ALC-MS characterization of non-glycan PTMs of antibody-based drugsYU Hai-Dong3,SHI Lian-Hua1,JIN You-Xun1*,HAN Rong-Xun2(1 National Institute of Metrology,Beijing 102200,China;2 College of Animal Sciences,Yangtze University,Jingzhou 434025,China;3 Shanghai Zhongqiao Vocational and Technical University,Shanghai 201514,China)Abstract:Antibody-based drugs often show high heterogeneity due to complex and diverse post-translational modifications(PTMs).As an important support for drug development,characterization of PTMs can provide guidance and reference for drug screening,drug discovery,process development and optimization.LC-MS has become a powerful tool for identification and characterization of PTMs,due to the advantages of rapidness and high accuracy.Here we provide an overview of identification results of non-glycan PTMs of antibody-based drugs,including modification types,modified sites,located regions,expression systems and the resultant potential effects.Also,LC-MS based analytical strategies for characterization are discussed.We hope this paper can provide references for characterization of antibody-based drugs in the early development.PTMs reviewed in this paper were all identified by LC-MS or LC-MS/MS.Key words:antibody-based drugs;LC-MS;characterization;post-translational modifications抗体类药物已成为新疗法中的代表药物，能有效治疗癌症、自身免疫性疾病、神经系统疾病及传染病1，为患者提供了许多新的药物治疗选择。抗体类药物研发也成为目前生物医药行业发展最快的领域之一2。抗体类药物在研制阶段往往会产生多种不同形式的异质体，其中，电荷异质体主要由翻译后修饰(post-translational modifications,PTMs)产生3-5。PTMs会对药物的稳定性、疗效和安全性产生影响1，其类型和水平是评价抗体类药物质量属性时需要关注的重点。在早期研发阶段，需要对异质体进行快速准确的表征分析，评估候选药物的质量属性，为药物筛选、工艺开发提供依据。传统的抗体药物异质体(相关物质和相关杂质)表征主要包括分子大小变异体表征、电荷变异体表生命科学第35卷770征及聚糖(糖基化)修饰表征。分子大小变异体的表征方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)6、毛细管电泳(capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfate,CE-SDS)6-7及体积排阻色谱(size exclusion chromatography,SEC)8。其中，SDS-PAGE既可用于纯度测定，也可通过使用蛋白质 Marker测定抗体类药物的分子量，但准确度较低6,9；CE-SDS 和 SEC 是测定抗体类药物纯度的常用方法，也用于单体、聚体及片段的定量分析10-12。电荷异质体的表征方法有平板等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)13、毛细管等电聚焦(capillary isoelectric focusing,CIEF)14、全柱成像毛细管等电聚焦(imaged CIEF,iCIEF)15、毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis,CZE)16、阳离子交换色谱(cation exchange chromato-graphy,CEC)17及阴离子交换色谱(anion exchange chromatography,AEC)18。其中，IEF、CIEF 与 iCIEF是基于等电点不同的分离技术，也用于测定等电点；CZE 是基于质量与电荷比值差异的分离技术；CEC与 AEC 是基于电荷差异及电荷异质体与色谱柱介质之间作用力差异的分离技术。电荷异质性的表征方法均是基于电荷差异分离出主峰、酸性峰(酸性变体)和碱性峰(碱性变体)。电荷异质体主要由PTMs产生，不同的PTMs会形成不同的电荷异质体，例如，脱酰胺会形成酸性变体，C-端赖氨酸未完全切除可形成碱性变体19，通过分离出酸性峰和碱性峰对 PTMs 进行表征分析。此外，反相高效液相色谱(reverse phase liquid chromatography,RPLC)也用于抗体类药物的纯度分析及杂质分析20。聚糖修饰表征常用的技术是亲水作用色谱(hydrophilic interaction chromatography,HILIC)21。传统的异质体表征方法以液相色谱和电泳分离技术为主，无法获得各异质体的准确分子量。质谱技术能够精确地测定药物分子的质量，实现抗体类药物异质体的识别和鉴定。与传统表征技术相比，基于质谱的表征技术具有高分辨率、高通量、高精度的绝对优势，已成为药物研发不可缺少的分析手段，是抗体类药物结构表征及 PTMs 分析最有力的工具22-23。尤其是液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术，可在完整抗体、脱糖抗体、亚基及脱糖亚基水平上对异质体进行全面系统的表征，通过高分辨率质谱准确测定质量偏移值来识别、分析 PTMs。此法简便、准确、直接、快速，10 min 即可完成一个样品的测定24。LC/MS/MS 肽图分析虽然能够在氨基酸残基水平上精确地鉴定 PTMs 的类型和修饰位点，也能对 PTMs 进行定量分析25，但会因酶切处理引入修饰26，且肽图数据处理与分析都是非常耗时的工作。因此，在早期研发阶段，快速、直接的LC-MS 表征分析尤为实用，通过测定分子量，检测分子量是否符合设计，对分子大小变体和 PTMs 进行表征分析。而由于聚糖修饰的复杂性，通常使用糖苷酶 PNGase-F 脱去 N-糖24,27，再进行脱糖抗体和经还原处理得到的脱糖亚基的分子量测定24，由此得到的解卷积质谱图更易于分子大小变体及非聚糖 PTMs 的表征分析。如果抗体类药物含有复杂多样的非聚糖 PTMs，LC-MS 数据的解析难度会随之增大。因此，不断更新抗体类药物的 PTMs 信息，有利于更有效地使用质谱分析软件对 LC-MS 数据进行解析，提高表征分析的质量。本文综述了抗体类药物非聚糖 PTMs 的质谱鉴定成果，涉及到的抗体类药物包括 IgG 单抗、双特异性抗体、融合蛋白及抗体偶联(antibody-drug conjugates,ADC)药物，并对表征分析策略进行了一定的探讨，希望为抗体类药物早期研发阶段的表征分析提供参考。1抗体类药物非聚糖PTMs目前已知的蛋白质 PTMs 有 400 多种22。随着表征分析技术的不断发展，越来越多的新型PTMs 被发现28，质谱分析软件也在不断的升级，为飞速发展的抗体类药物研发提供支撑。已报道的由 LC-MS 及 LC-MS/MS 确证的抗体类药物非聚糖 PTMs 主要包括末端修饰、脱酰胺(deamidation)、氧化(oxidation)、羟基化(hydroxylation)、糖化(glycation)、硫酸化(sulfation)、磷酸化(phosphorylation)及半胱氨酸相关修饰。1.1脱酰胺修饰脱酰胺修饰是抗体类药物常见的修饰，天冬酰胺和谷氨酰胺都可以发生脱酰胺修饰。相关研究结果显示抗体类药物的脱酰胺修饰主要发生在天冬酰胺，产物为天冬氨酸(+1 Da)、异天冬氨酸(+1 Da)或琥珀酰亚胺(succinimide)中间体(17 Da)29-30。需要注意的是，现阶段的高分辨率质谱仪测定完整抗体分子量的准确度在 2 Da 之内26。因此，在LC-MS 表征分析抗体类药物时，无法仅依据+1 Da的质量偏移就判断可能存在脱酰胺修饰31。互补决定区(complementarity determining region,CDR)的脱酰胺修饰可能导致抗体亲和力与药效的俞海东，等：抗体类药物非聚糖翻译后修饰的LC-MS表征分析第6期771降低。2009 年，Vlasak 等29报道，轻链 CDR 区的天冬酰胺发生脱酰胺修饰转变成天冬氨酸和异天冬氨酸时会导致抗体亲和力的降低。同年，Yan 等32报道，重链 CDR 区的天冬酰胺发生脱酰胺修饰转变成琥珀酰亚胺时，Fab 的亲和力降低了约 50%，药效降低了约 70%。1.2氧化与羟基化修饰抗体类药物最容易发生的氧化修饰是甲硫氨酸的氧化，产生+16 Da 的质量偏移33-35；此外，色氨酸也会发生氧化修饰，经不同的氧化途径，可生成犬尿氨酸(+4 Da)、羟基色氨酸(+16 Da)、羟基吲哚丙氨酸(+16 Da)、二