基于KASP平台的转基因玉米高通量特异性检测方法_朱少喜.pdf

技术与方法生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(6):133-140收稿日期：2022-09-26基金项目：国家“十三五”重点研发计划（2016YFD0101803），黑龙江省自然科学基金联合引导项目（LH2019C056）作者简介：朱少喜，硕士研究生，研究方向：玉米分子鉴定；E-mail:；金肇阳为本文共同第一作者通讯作者：路运才，男，博士，教授，研究方向：玉米种质资源创新与利用；E-mail:；王凤格，女，博士，研究员，研究方向：玉米分子鉴定；E-mail:基于 KASP 平台的转基因玉米高通量特异性检测方法朱少喜1，2 金肇阳1，2 葛建镕2 王蕊2 王凤格2 路运才1（1.黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080；2.北京市农林科学院玉米研究所 玉米 DNA 指纹及分子育种北京市重点实验室，北京 100097）摘 要：为了促进转基因玉米产业化发展，加快优良性状转化体与骨干自交系的转育工作，适用于回交群体的高通量前景选择方法亟待开发。本研究以转基因玉米 DBN9936 为材料，根据其外源插入片段及其侧翼序列，采用 primer5 软件设计了 6 对特异性引物，与内标准基因 zSSIIb 引物进行组合用于评估，获得最优引物组合后，进一步开展特异性验证、检出限测试和多样品验证。结果显示，最优引物组合为 DBN9936-LB1*zSSIIb-k1；10 份 DBN9936 BC1代种子的 KASP 基因分型结果与琼脂糖凝胶电泳结果完全一致；10 份转化体 DBN9858、DBN9501、C0010.1.3、C0010.3.1、C0010.3.7、C0030.2.5、BT11、GA21、MIR162 和 2A-7 的转基因玉米样品在双平台上检测结果均表现为阴性；转基因玉米 DBN9936 的检出限为 10%；48 份不同 DBN9936 杂交种材料的 KASP基因分型结果均表现为阳性。综上，本研究方法可用于转基因玉米 DBN9936 回交转育过程中的前景选择，且样品通量高，为其他农作物在转基因育种过程中的目标基因检测提供了技术参考。关键词：转基因玉米；回交转育；前景选择；KASP 平台；高通量DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2022-1191High-throughput Specific Detection Methods for Transgenic Maize Based on the KASP PlatformZHU Shao-xi 1,2 JIN Zhao-yang1,2 GE Jian-rong2 WANG Rui2 WANG Feng-ge2 LU Yun-cai1（1.College of Advanced Agriculture and Ecological Environment of Heilongjiang University,Harbin 150080;2.Maize Research Center,Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Beijing Key Laboratory of Maize DNA Fingerprinting and Molecular Breeding,Beijing 100097）Abstract:In order to promote the industrialization of transgenic maize and accelerate the transfer of excellent trait transformants and backbone inbred lines,high-throughput foreground selection methods for backcross population need to be developed urgently.In this study,the transgenic maize DBN9936 was used as the material,according to its exogenous insert fragment and its flanking sequence,6 pairs of specific primers were designed using the primer5 software,combined with the internal standard gene zSSIIb primer for evaluation.After obtaining the optimal primer combination,further the specificity verification,detection limit testing and multi-sample verification were carried out.The results showed that the optimal primer combination was DBN9936-LB1*zSSIIb-k1;the results of KASP genotyping of 10 DBN9936 BC1 seeds were completely consistent with those of agarose gel electrophoresis;the results of 10 transformants DBN9858,DBN9501,C0010.1.3,C0010.3.1,C0010.3.7,C0030.2.5,BT11,GA21,MIR162 and 2A-7 were negative on the dual platform.The detection limit of transgenic maize DBN9936 was stable at 10%;and the KASP genotyping results of 48 different DBN9936 hybrids were positive.In summary,this method can be used for the foreground selection in the process of backcrossing of transgenic maize DBN9936 with high sample throughput,which provides a technical reference for target gene detection of other crops in transgenic breeding.Keywords:transgenic maize;backcross breeding;foreground selection;KASP platform;high throughput生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.6134自 2019 年以来，我国先后批准了 DBN9936、瑞丰 125、DBN9858、DBN9501、ND207、浙大瑞丰 8、DBN3601T、nCX-1、Bt11GA21、Bt11MIR162-GA21、GA21 共 11 个玉米转化体的生产应用类生物安全证书。2022 年 6 月 8 日，国家农作物品种审定委员会印发了 国家级转基因玉米品种审定标准（试行），这些举措标志着我国转基因玉米产业化发展已是必然趋势。回交转育作为转基因玉米新品种创制过程中的一环，是转基因玉米实现商业化种植前必须完成的工作1。在回交早代进行大规模群体前景选择和背景评估，能够有效缩短回交育种周期，但这无疑对实验室检测的样品通量提出较高的需求。资料表明，基于 DNA 的 PCR 方法是可靠且通用的转化体检测途径2。目前，通常采用普通 PCR3、多重PCR4、实时荧光定量 PCR5、数字 PCR6等手段进行转化体事件的鉴定。但这些方法，均存在样品通量偏低、耗时偏长等缺点，不适用于大量样本的高效检测。因此需要建立一套高效的转基因玉米目标基因检测手段，用于快速准确地筛选出转基因育种群体中含有目标基因的群体材料7。KASP 平台因其具有成本低、通量高、操作简单等优势，目前已经广泛应用于种质资源评价8、分子辅助育种9、基因定位10、种子纯度鉴定11等领域，但将 KASP 平台用于转基因检测鲜有报道。本研究以转基因玉米 DBN9936 为研究对象，开发并筛选出最优的转化体特异性引物与内标准基因引物组合，建立了一套基于 KASP 平台的回交转育过程中的高效前景选择方法。该方法具有快速准确、样本通量高等优点，为农作物中具有样品高通量检测需求的转化体的回交群体前景选择提供了技术参考。1 材料与方法1.1 材料48 份转基因玉米 DBN9936 杂交种、10 份转基因玉米 DBN9936 BC1代种子和 2 份京科 968（阴性对照）种子，均由北京市农林科学院玉米研究所提供。转基因玉米（DBN9936、DBN9858、DBN9501、C0010.1.3、C0010.3.1、C0010.3.7、C0030.2.5、BT11、GA21、MIR162 和 2A-7）标准品各 1 份，购自农业农村部科技发展中心。1.2 方法1.2.1 DNA 提 取 采 用 磁 珠 法 提 取 DNA12，NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific）检测 DNA浓度和质量，统一稀释为 10 ng/L 备用，-20保存。1.2.2 引物设计 根据 DBN9936 外源插入片段 5端和 3 端的边界序列信息：SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4（表 1）13，基于 KASP 引物设计原则，使用 primer5 软 件（http:/ 1 DBN9936 边界序列 SEQ NO.ID 3 和 SEQ NO.ID 4Table1 DBN9936 border sequences SEQ NO.ID 3 and SEQ NO.ID 4编号 No.核苷酸序列 Nucleotide sequenceSEQ NO.ID 3661 CCGCCGTATC TCCCGCCTCT CGCGCGCCAT CTC-CCACACG CCGCCGCCGA 711 TCCTCTCTCTC GTCCTACGC CCACGAATGG CTCTC-CAGCT GGAGAAAACC 761 GGCGGCCAGT GGATCCACCA TCAGGGGCAA GAAAACATCC CAAAACGCTA 811 GGCTCATGGG CACACAAGAC ACATTGTGGT GTA-AACAAAT TGACGCTTAG 861 ACAACTTAAT AACACATTGC GGATACGGCC AT-GCTGGCCG CCCCGCGCCG 911 ATCTAGTAAC ATAGATGACA CCGCGCGCGA TA-ATTTATCC TAGTTTGCGC961 GCTATATTTT GTTTTCTATC GCGTATTAAA TG-TATAATTG CGGGACTCTA SEQ NO.ID 48001 TACATTAAAA ACGTCCGCAA TGTGTTATTA AGTTGTCTAA GCGTCAATTG 8051 GATCCCGTGG TCCCGGTCCC GTTTAAACCT AAT-CAGTCAG TGCCGGTGAG 8101 AGCGTAGCTG CCTGGAAGCG GCCTCGTCAG CCAACACCGT GAGGCTAGTG 8151 CCATCAATAA GTTATCAGTC AAACGGTCC GTTTAAACTA TCAGTGTTTG 8201 AAAGCGAGGC