circSNRK通过上调A...管上皮细胞缺血-再灌注损伤_孟凡航.pdf

第 14 卷 第 4 期2023 年 7 月Vol.14 No.4Jul.2023器官移植Organ Transplantation论著circSNRK通过上调Akt通路改善肾小管上皮细胞缺血-再灌注损伤孟凡航崔瑞文陈秋源顾世杰曹荣华【摘要】目的 探讨环状 RNA SNRK（circSNRK）在缺血-再灌注损伤（IRI）中的作用及机制。方法 构建缺氧-复氧（IRI）细胞模型，检测 IRI 处理后 circSNRK 的表达情况及过表达 circSNRK 对细胞增殖和细胞凋亡的影响。分析 circSNRK 的作用靶点。将 HK2 细胞分为空白组（Mock 组）、IRI 组、对照质粒+IRI 组（IRI+NC组）、过表达人 circSNRK+IRI 组（IRI+circSNRK 组）、过表达人 circSNRK+IRI+蛋白激酶 B（Akt）抑制剂组（IRI+circSNRK+MK2206 组）、对照质粒组（NC 组）。检测 Mock 组、IRI 组、IRI+NC 组、IRI+circSNRK 组细胞增殖及凋亡情况。进行 circSNRK 作用靶点的基因本体（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）聚类分析。检测 Mock 组、IRI 组、IRI+NC 组、IRI+circSNRK 组细胞 CDKN1A、Akt、B 细胞淋巴瘤（Bcl）-2、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-9信使RNA（mRNA）表达水平，p21、Bcl-2、Caspase-9、Akt、p-Akt蛋白表达水平。检测NC组、IRI+NC组、IRI+circSNRK组、IRI+circSNRK+MK2206组细胞增殖及凋亡情况。结果 与Mock组比较，IRI 组 circSNRK 表达水平较低，HK2 细胞增殖能力下降，细胞凋亡增多。IRI+circSNRK 组细胞增殖能力较 IRI+NC组升高，细胞凋亡较 IRI+NC 组减少。circSNRK 可通过 51 个微小 RNA（miRNA）作用于 648 个靶点。GO 富集分析显示，circSNRK作用靶点主要富集于细胞过程和生物调节等生物学过程，细胞部分、细胞和细胞外部分等细胞成分，以及结合、结合蛋白和酶等分子功能。KEGG 聚类分析显示，circSNRK 作用靶点主要富集在癌症信号通路、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）-Akt 信号通路和癌症 miRNA 等相关通路。与 Mock 组比较，IRI 组 CDKN1A 和 Caspase-9 mRNA 相对表达量较高，miR-99a-5p RNA 表达水平较高，Akt 和 Bcl-2 mRNA 相对表达量较低；与 IRI+NC 组比较，IRI+circSNRK 组 CDKN1A 和 Caspase-9 mRNA 相对表达量较低，Akt 和 Bcl-2 mRNA 相对表达量较高，miR-99a-5p RNA 表达水平较低，差异均有统计学意义（均为 P0.05）。IRI 组 p21 和 Caspase-9 蛋白表达较 Mock 组增多，p-Akt、Akt 和 Bcl-2 蛋白表达较 Mock 组减少；IRI+circSNRK 组 p21 和 Caspase-9 蛋白表达较 IRI+NC 组减少，p-Akt、Akt 和 Bcl-2 蛋白表达较 IRI+NC 组增多。circSNRK 和 Akt 上存在 miR-99a-5p 结合位点。与 NC 组比较，IRI+NC 组细胞增殖能力下降；与 IRI+NC 组比较，IRI+circSNRK 组细胞增殖能力升高；与 IRI+circSNRK 组比较，IRI+circSNRK+MK2206 组细胞增殖能力下降（均为 P0.05）。IRI+NC 组细胞凋亡水平较 NC 组高；IRI+circSNRK组细胞凋亡水平较 IRI+NC 组低；IRI+circSNRK+MK2206 组细胞凋亡水平较 IRI+circSNRK 组高。结论 在 IRI 条件 下，circSNRK 可影响 HK2 细胞增殖和凋亡，可能是通过 Akt 通路发挥作用。【关键词】肾移植；缺血-再灌注损伤；环状 RNA；微小 RNA；蛋白激酶 B；细胞凋亡；细胞增殖；作用靶点【中图分类号】R617，R692【文献标志码】A【文章编号】1674-7445（2023）04-0009-10DOI:10.3969/j.issn.1674-7445.2023.04.009 基金项目：广东省基础与应用基础研究基金（2021A1515010677）作者单位：510120 广州，广州中医药大学第二附属医院器官移植科作者简介：孟凡航（ORCID：0000-0002-4739-3468），硕士研究生，主治医师，研究方向为肾移植、缺血-再灌注损伤，Email：mfh6491 通信作者：曹荣华（ORCID：0009-0009-2070-8405），博士，主任医师，研究方向为肾移植，Email：circSNRK alleviates ischemia-reperfusion injury in renal tubular epithelial cell by up-regulating Akt pathway Meng Fanhang,Cui Ruiwen,Chen Qiuyuan,Gu Shijie,Cao Ronghua.Department of Organ Transplantation,the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510120,ChinaCorresponding author:Cao Ronghua,Email:530第 14 卷器官移植缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）是缺血引起的组织缺氧后血液回流，由于活性氧的积累和炎症反应的激活而导致严重的损害1-2。肾移植受者 IRI 发生率为 30%50%，是导致肾移植术后急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）和移植物功能延迟恢复的危险因素3-7。由于机制复杂且缺乏适当的治疗靶点，目前很少有专门针对肾 IRI 发病机制的干预措施。环状 RNA（circular RNA，circRNA）是一类具有共价闭环结构的单链非编码 RNA8。随着测序技术和生物信息学的不断发展，circRNA 种类和生物学功能领域的相关研究不断增多，目前 circRNA 作为人类疾病的生物标志物已开始实际应用9-10。前期我们在大鼠 AKI 模型中发现 SNRK 基因（一种 Ser/Thr 类蛋白激酶）来源的一个 circRNA 在 AKI 中表达下调，并参与 AKI 的进程。抑制大鼠 circSNRK 可【Abstract】Objective To investigate the role and mechanism of circular RNA SNRK(circSNRK)in ischemia-reperfusion injury(IRI).Methods A hypoxia-reoxygenation(IRI)cell model was established.The expression level of circSNRK after IRI treatment and the effect of overexpression of circSNRK on cell proliferation and apoptosis were detected.The targets of circSNRK were identified.HK2 cells were divided into the blank group(Mock group),IRI group,control plasmid+IRI group(IRI+NC group),human circSNRK overexpression+IRI group(IRI+circSNRK group),human circSNRK overexpression+IRI+protein kinase B(Akt)inhibitor group(IRI+circSNRK+MK2206 group)and control plasmid group(NC group).Cell proliferation and apoptosis were detected in the Mock,IRI,IRI+NC and IRI+circSNRK groups.The gene ontology(GO)and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)pathway enrichment analyses of the target of circSNRK were carried out.The expression levels of CDKN1A,Akt,B-cell lymphoma(Bcl)-2,cysteinyl aspartate specific proteinase(Caspase)-9 messenger RNA(mRNA),and those of p21,Bcl-2,Caspase-9,Akt and p-Akt proteins were detected in the Mock,IRI,IRI+NC and IRI+circSNRK groups,respectively.Cell proliferation and apoptosis were determined in the NC,IRI+NC,IRI+circSNRK and IRI+circSNRK+MK2206 groups.Results Compared with the Mock group,the expression level of circSNRK was lower,and cell proliferation capability of HK2 cells was decreased and cell apoptosis was increased in the IRI group.In the IRI+circSNRK group,cell proliferation capability was higher,whereas cell apoptosis was lower than those in the IRI+NC group.circSNRK could act on 648 targets through 51 microRNAs(miRNAs).GO enrichment analysis revealed that the targets of circSNRK were mainly enriched in biological processes(such as cell process and biological regulation),cell components(such as cell parts,cells and extracellular parts),and molecular functions(such as binding,binding proteins and enzymes).KEGG enrichment analysis showed that the targets of circSNRK were mainly enriched in cancer signaling pathway,phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K)-Akt signaling pathway,miRNA in cancer and other relat