基于网络药理学和实验验证探...治疗甲型流感病毒的作用机制_张悦.pdf

世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.药物研究：基金项目：国家自然科学基金（）作者单位：北京中医药大学第三附属医院，北京；中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，传染病预防控制国家重点实验室，北京；北京中医药大学东直门医院，北京 通信作者：王成祥，：基于网络药理学和实验验证探索千金三黄汤加减治疗甲型流感病毒的作用机制张悦，于会勇 宋利琼 李金桐 满天 程锦涛 王成祥【摘要】目的 预测基于千金三黄汤加减的“麻黄 黄芩 黄芪 鱼腥草”配伍治疗甲型流感病毒感染的潜在作用靶点及作用机制，以期丰富抗流感病毒的复方配伍。方法通过中药系统药理学分析平台数据库（）、数据库、数据库筛选麻黄、黄芩、黄芪、鱼腥草的活性成分与潜在靶点。使用 数据库筛选流感病毒感染的疾病相关靶点，利用微生信平台中“集合运算 图”获得药物与甲型流感病毒的交集靶点。通过 软件构建“药物 活性成分 作用靶点”网络并进行拓扑分析。利用 数据库构建蛋白质 蛋白质互作（）网络，并通过 软件进行拓扑分析，获得核心靶点。并应用 数据库进行 及 富集分析。流感病毒 构建 小鼠感染模型，观察小鼠一般状态、肺指数、肺组织病理，及 对部分核心靶点及抑炎因子表达进行检测。结果 得到“麻黄 黄芩 黄芪 鱼腥草”配伍的活性成分 个，潜在靶点 个。甲型流感病毒相关的疾病靶点 个。药物与疾病的交集靶点 个。富集获得 个条目，通路富集获得 个条目，涉及 信号通路、流感通路、通路、型凝集素受体信号通路、信号通路、信号通路、凋亡通路、分化等多个流感相关的通路。实验结果表明，中药干预后可以改善感染小鼠一般状态及感染诱发的结肠缩短，减轻肺指数与肺组织病理损伤，下调核心靶点中促炎因子 、的表达、上调抑炎因子 的表达。结论 基于千金三黄汤加减的“麻黄 黄芩 黄芪 鱼腥草”配伍可以多成分、多途径发挥抗甲型流感病毒的作用，可能通过 、等核心靶点调控 信号通路、信号通路、信号通路等减轻甲型流感病毒所致的肺组织免疫炎性损伤，初步证实了该配伍治疗甲型流感病毒感染的部分作用靶点及对感染小鼠的保护作用。【关键词】甲型流感病毒；千金三黄汤；网络药理学【中图分类号】【文献标识码】，（，；，；，）【】，（）（），（），世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.“”（），（）（），（，），【】；甲型流感病毒（，）是诱发呼吸系统急性感染的重要病原体，具有高传染性、高发病率、高病死率的特点。据统计，流感病毒感染每年造成的死亡人数多达 人，大大增加全球公共卫生负担。当前已有研究表明，与严重急性呼吸系统综合征冠状病毒（，）共感染率高达 ，感染会增强 的感染性，导致呼吸系统症状迅速恶化，造成更严重的病理损伤。因此在疫情常态化形势下，有效防控 感染具有重要的临床意义。病毒的高变异性与耐药的发生、药物研发的滞后、疫苗接种率低、药物存在出血、神经精神系统等不良反应 导致 感染的治疗仍然面临重要挑战。研究表明，中药单药与复方可通过对病毒的直接抑制与宿主免疫调节途径干预流感病毒造成的组织损伤。角药一词由杨发贵首次提出，姜良铎教授认为角药针对病因、病机、病证，成三足鼎立之势，药物之间相互制约、协同增效。千金三黄汤出自备急千金要方卷八引张仲景方，原方主治“中风手足拘急，百节疼痛，烦热心乱，恶寒，经日不欲饮食”，究其病机，如医门法律言“风入荣卫肢节之间邪盛正虚可知”，与外感病邪气外客之“两虚相得，乃客其形”相符。以麻黄开发腠理，以黄芩清解风热，以黄芪佐麻黄开泄，并杜绝虚风复入之路，是治疗正虚邪客的核心角药，去原方中独活、细辛改鱼腥草，入手太阴以引药达肺，清肺中热毒痰痈，增强黄芩清解之效，四药合用直中病机，直达病所，然而目前缺乏对流感病毒的治疗作用评价。本研究拟通过网络药理学探究麻黄 黄芩 黄芪 鱼腥草的活性成分、作用靶点，进一步通过动物实验评估对流感病毒的干预作用及部分作用机制，为该组合在临床的进一步应用提供理论依据。材料与方法 网络药理学分析 数据库应用 数据库（：），数据库（：），数 据 库（：），数据库（：），数据库（：），数据库（：），软件（：），数据库（：），微 生 信 平 台（：）。药物活性成分筛选及潜在靶点预测利用 数据库分别检索麻黄、黄芩、黄芪、鱼腥草四种药物，根据药物代谢动力学核心参数，将类药性（，），口服生物利用度（，）作为筛选条件，获得四味中药的关键活性成分及其对应的靶点。随后利用 数据库检索药物活性成分的 结构图，导入到 数据库中进行活性成分的靶点预测，对 预测的潜在靶点进行补充。通过 数据库对药物的潜在靶点 世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.进行规范化。甲型流感病毒相关靶点筛选利用 数据库，以“”“”“”为检索词收集甲型流感病毒的潜在靶点，将所得靶点信息进行合并后去重，得到甲型流感病毒相关的靶点信息。药物治疗甲型流感病毒感染的潜在靶点筛选将药物活性成分的作用靶点和甲型流感病毒相关的疾病靶点输入微生信平台“集合运算 图”分析工具，获得药物作用靶点与甲型流感病毒感染的交集靶点，即药物治疗甲型流感病毒感染的潜在靶点。药物 活性成分 作用靶点网络构建与蛋白质 蛋白质互作（）网络构建利用 软件对药物、活性成分与作用靶点进行可视化。将药物与疾病的交集靶点导入 数据库，最小互作阈值“”，获得交集靶点的 网络，将分析获得的 数据导入 软件进行拓扑分析并可视化：通过 对文件进行初步分析，插件进行中位数筛选，获得核心靶点。功能富集及 通路富集分析将药物与疾病的交集靶点导入到 数据库，设置最小富集数为，富集因子 ，对靶点进行 及 富集分析。使用微生信平台对、富集结果进行可视化。动物实验验证 实验动物与病毒株 级 小鼠，体质量 ，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：（京）；甲型流感病毒 鼠肺适应株（简称），由中国疾病预防控制中心传染病所免疫实验室 冻存。细胞培养传代，测得血凝滴度为 ，噬斑实验测得浓度为 。动物实验通过中国疾病预防控制中心实验动物福利和伦理委员会审查。动物实验及后续相关指标检测均在二级生物安全实验室进行。药 物中药配方颗粒（北京康仁堂药业有限公司），方药组成：炙麻黄 ，黄芩 ，黄芪 ，鱼腥草。给药前将颗粒于研钵中研磨成粉末，置于 灭菌离心管，去离子水溶解后 温浴 。试 剂（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，货号：），（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，货号：），（，货 号：），三氯甲烷（国药集团化学试剂有限公司，货号：），异丙醇（国药集团化学试剂有限公司，货号：），无水乙醇（上海麦克林生化科技有限公司，货号：），（）（宝日医生物技术（北京）有限公司，货号：），（）（宝日医生物技术（北京）有限公司，货号：），多聚甲醛固定液（武汉塞维尔生物科技有限公司，货号：），（，货号：）。仪 器生物安全柜（级 型）（美国 公司，型号：）；倒置显微镜（带图像分析系统）（日本尼康，型号：）；高通量组织研磨仪（德国 公司，型号：）；小型台式高速冷冻离心机（德国 公司，型号：）；分光光度计（美国 公司，型号：）；仪（德国 公司，型号：）；实时荧光定量 仪（杭州博日，型号：）；酶标仪（，型号：）。分组与造模将小鼠按随机数字表法分为空白组、模型组、药物干预组，每组各 只。小鼠适应性喂养 ，除空白组外，其余组异氟烷轻度麻醉后，稀释好的 病毒悬液（感染浓度 ）滴鼻，每只小鼠 ，造模后连续观察 。给 药流感病毒感染 后灌胃给药。按人与小鼠体表面积折算法进行等效剂量换算，根据预实验选择 倍等效剂量，即小鼠按 （）给药，次，次，连续灌胃 ，模型组予等体积 灌胃。标本采集于流感病毒感染后第 天异氟烷轻度麻醉后摘眼球取血。取小鼠肺组织，称取肺脏重量，取右肺小块组织于 多聚甲醛中固定，剩余右肺组织与世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.左侧肺组织分别保存于 中，内弃，将组织转入 冰箱保存，取小鼠结肠组织，测量结肠长度。指标检测（）小鼠一般状态：观察各组小鼠精神状态、体质量、活动、皮毛等情况。（）肺指数：称取小鼠体重与肺脏总重量，计算肺指数。肺指数 肺脏质量（）体质量（）。（）肺组织病理：肺组织于 多聚甲醛溶液中固定，经石蜡包埋、切片（）、苏木素 伊红（）染色后，显微镜下观察病理变化。（）法检测肺组织中抗炎因子 分泌：取 圆底离心管，分别加入研磨钢珠与 ，冰箱取出左肺组织，使用组织 研 磨 仪 进 行 组 织 匀 浆，以 离 心 半 径 ，离心，离心分离上清，每管 分装，冻存备用。按照 试剂盒说明书进行操作，检测样本中 的表达水平。（）法 检 测 肺 组 织 中 核 心 靶 点、的表达水平：冰箱取出右肺组织，采用 法提取各组样本的总，并利用分光光度计检测 浓度。根据 试剂说明进行反转录，合成，保存备用。以为模板，按照 试剂说明进行引物扩增，引物序列见表。反应体系为 ，其中 。反应条件：，个循环。采用法计算目的基因的相对表达量。表 引物序列引物序列（）长度（）上游 下游 上游 下游 上游 下游 上游 下游 上游 下游 上游 下游 统计学方法采用 统计学软件进行数据分析，软件对结果进行可视化。计量资料以均数 标准差（）表示，多组间差异采用单因素方差分析（），方差齐时，用 进行多重比较，方差不齐时，采用 秩和检验。结 果 药物活性成分与靶点筛选利用 数据库以、为筛选条件，获得麻黄活性成分 个，黄芩活性成分 个，黄芪活性成分 个，鱼腥草活性成分 个。结合 数据库靶点结果，得到各成分的作用靶点，其中麻黄 个，黄芩 个，黄芪 个，鱼腥草 个。利用 数据库对靶点名称进行规范化，删除未匹配到的靶点，合并药物靶点，删除重复值后，共得到药物靶点 个。甲型流感病毒相关靶点筛选通过 数据库获得疾病靶点后，利用中位数对靶点信息的 进行筛选，合并不同检索词获得的靶点信息，去重后得到甲型流感病毒感染相关靶点 个。药物 活性成分 靶点网络分析利用 软件对药物 活性成分 靶点网络进行分析及可视化，结果见图。网络包括 个节点，条边。随后进行拓扑结构分析，利用平均值对度值、中介中心性（，）和紧密中心性（，）进行筛选，最终得到 个核心靶点，其中包括、等多个参与炎症反应的靶点基因。药物活性成分中排名前三位的分别是（槲皮素）、（山奈酚）、（二氢异黄酮）。核心靶点与核心活性成分参数见表。潜在治疗靶点预测与 网络构建将药物的作用靶点和甲型流感病毒的疾病相关靶点输入微生信平台，获得药物与甲型流感病毒感染的交集靶点 个，结果见图。利用 数据库对交集靶点进行 网络构建，共包括 个节点，条边。通过 插件以中位数为条件对交集靶点的度值、进行筛选，最终获得 个核 心 靶 点，分 别 为、，拓扑参数见表，网络构建见图。功能富集与 通路富集分析利用 数据库分析，功能富集得到 个条目，其中生物过程（）个，细胞组分（）个，分子功能（）个。富集分 世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.图 “药物 活性成分 靶点”网络图表 药物核心靶点与核心活性成分拓扑学参数名称度值中介中心性紧密中心性名称度值中介中心性紧密中心性 析共得到 条信号通路。按 对 功能富集与 通路富集条目进行筛选，并通过微生信平台进行可视化，结果见图、。功能富集中，主要涉及细胞对有机氮化合物的反应、正调控细胞运动性、凋亡信号通路的调节等，主要涉及膜筏、囊泡腔、质膜等，主要涉及蛋白激酶活性、细胞因子受体结合、磷酸酶结合、细胞因子活性等。通路富集中涉及的 信号通路、流世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.表 药物治疗流感病毒的核心靶点的拓扑学参数名称度值中介中心性紧密中心性名称度值中介中心性紧密中心性 图 药物与流感病毒交集靶点的 网络感通路、通路、型凝集素受体信号通路、信号通路、信号通路、凋亡通路、分化等通路与流感病毒感染及炎症反应密切相关。图 药物与甲型流感病毒相关靶点的 图图 药物治疗甲型流感病毒潜在靶点的 富集分析图 药物治疗甲型流感病毒潜在靶点的 富集分析 实验结果 小鼠一般状态空白组小鼠毛色光亮，反应迅速，第 天体质量为（）。模型组小鼠感染后第 天开始出现精神萎靡，活动度下降，逐渐出现明显耸毛、毛色黯淡，蜷缩，发抖，体重在第