华法林与人血清蛋白结合的动力学过程和光谱性能研究_唐妍.pdf

第 卷，第期 光谱学与光谱分析 ，年月 ，华法林与人血清蛋白结合的动力学过程和光谱性能研究唐妍，杨云帆，胡建波，张航，刘永刚，刘强强西南科技大学环境友好能源材料国家重点实验室，四川 绵阳 中国工程物理研究院流体物理研究所，四川 绵阳 西南科技大学分析测试中心，四川 绵阳 四川轻化工大学化学与环境工程学院，四川 自贡 摘要华法林作为口服维生素 拮抗剂几十年来广泛应用于治疗血栓类疾病。因此针对华法林的物理化学性质的研究成为了人们的重点。通过含时密度泛函理论（），模拟了华法林分子在水溶液状态下与人血清蛋白结合过程中几种状态的紫外可见吸收光谱（）与荧光光谱，研究不同状态在激发过程中的跃迁方式和电荷转移过程，以及光谱的差异，探究整个动力学过程的激发态变化机理。结果表明，华法林在水溶液中紫外可见吸收光谱表现出双吸收现象，双吸收现象主要由不同的激发态跃迁导致。未去质子化前，主要吸收峰波长为 ，去质子化后，吸收强度降低，波长红移，当华法林与血清蛋白结合后发生电荷转移导致吸收增益，波长 吸收峰强度最高。通过计算第一激发态（）的结构和激发能模拟华法林不同状态的荧光光谱，最初状态下荧光峰为 ，去质子化后，荧光强度降低，波长红移，结合后结构变化导致荧光增益。根据华法林的荧光光谱变化情况，说明其在整个动力学过程中存在不同的荧光发射过程。通过分子前线轨道分析和电子空穴分析研究整个动力学过程的电荷转移情况，表明华法林单体的荧光发射过程为局域激发，与蛋白质结合后荧光发射过程为电荷转移激发，结合后的荧光增益特征使华法林可以作为荧光探针。该研究揭示了华法林与蛋白结合过程中光谱变化机理，为以后探究分子结合动力学过程提供新型研究手段和理论支撑。关键词华法林；人血清蛋白；光谱；含时密度泛函理论；分子动力学模拟中图分类号：文献标识码：（）收稿日期：，修订日期：基金项目：国家自然科学基金项目（），西南科技大学博士基金项目（）资助作者简介：唐妍，女，年生，西南科技大学环境友好能源材料国家重点实验室硕士研究生 ：通讯作者 ：引言华法林（）作为口服维生素拮抗剂几十年来广泛应用于治疗房颤、深静脉血栓、心脏病。华法林的抗凝效果受药代动力学的影响，体内其他药物的相互作用，以及本身的体质都会影响华法林的作用效果，若过量使用华法林会使患者产生内出血等多种并发症，因此在用药时需严格监控用药量和药效。作为香豆素类化合物，其骨架上的结构变化和取代均会影响其生物活性。其手性异构体中，华法林的活性为华法林的倍，华法林由于其更高的活性和更快 的 代 谢 速 率，被 大 多 数 研 究 者 作 为 主 要 的 研 究对象。为了在治疗时更精确地设定用药量，针对华法林的结构图华法林结构图 以及物理化学性质的研究成为了人们的重点。等确认了与 蛋 白（）结 合 后 的 华 法 林 的 晶 体 结构。总结了华法林的异构现象与其特性相关的研究历史。等通过实验测定了不同溶剂条件下华法林的 光谱和荧光光谱。计算了 种华法林的同分异构体的能量和核磁共振谱（）来分析不同的异构体在不同条件下的稳定性。华法林的主要活性部分为两个六元环连接组成的香豆素环，其所在平面存在较特别的荧光特性，出色的光学性能，高量子产率和优异的稳定性。分子在生物系统中的结构变化和电荷转移会导致荧光的变化和猝灭，同时也会影响分子的活性。因此，分子的激发态性质和电荷转移能力可以用来评判物质的活性和反应速率，华法林的光谱性能和其与蛋白结合的动力学过程息息相关，但目前关于华法林的激发光谱和激发态性质的理论模拟研究较少。通过 模拟了华法林分子在水溶液环境下与人血清蛋白结合过程中几种状态的结构差异、电荷分布、光谱、荧光光谱和电荷转移过程；深入探究了激发过程中跃迁方式和电荷转移的不同对最终光谱产生的影响；揭示了华法林与血清蛋白结合的整个过程中激发态变化内在的机理。对华法林光谱和电荷转移过程的详细分析，可以为探究整个动力学过程中华法林的激发态变化，分析华法林与人血清蛋白结合 的动力 学 过 程提供 一 种 新型 研 究 手 段 和 理 论支撑。实验部分 计算细节华法林与人血清蛋白的动力学模拟通过 实现，对人血清蛋白与华法林分子的配体使用 联合原子力场进行能量最小化，压力与温度平衡，稳定后在 温度下进行 的动力学模拟，从整个动力学过程中提取得到华法林与血清蛋白结合后的结构。所有计算均通过 软件，采用密度泛函理论（）和含时密度泛函理论（）进行。华法林的三种状态均在 级别下计算，添加了 色散矫正，采用基于密度的溶剂模型（）为三种结构添加了水溶剂环境后优化各状态水溶液下的基态结构（）。计算得到各状态稳定结构下激发态的激发能和振子强度模拟紫外可见吸收光谱（）。优化激发态结构并计算得到的荧光发射能和振子强度模拟各状态的荧光光谱。通过 计算各结构的静电势来分析静电相互作用，计算分子前线轨道来研究分子周围电子云的分布。对各激发态进行电子空穴分析，模拟研究不同结构激发过程 前 后 电 子 和 空 穴分布的变化分析其电荷转 移 的能力。模拟结果华法林（）为开链异构体，是华法林几十种异构体中最稳定的同分异构体，也是与人血清蛋白结合时的异构体，华法林（）是华法林（）去质子化，脱去一个氢原子后的结构，当华法林（）在水溶液以及碱性溶液环境下，其结构就会转化为华法林（）。华法林（）为华法林（）与人血清蛋白结合后的结构。华法林药物在水溶液中未去质子化前，结构为华法林（）；在水溶液中去质子化形成过渡态，与人血清蛋白结合前，结构为华法林（），当其与人血清蛋白结合后，华法林分子结构变为华法林（）。图华法林水溶液下不同状态优化结构图中原子：青色为碳，红色为氧，白色为氢 ：，结果与讨论 静电势分析分析华法林分子的静电相互作用有助于解释华法林与蛋白质的结合方式，分析华法林电子密度的分布可以预测其光激发过程。通过静电势（，）分析，可以直观地揭示分子结构上各位置的电荷分布和静电相互作用。图给出了华法林三种状态的静电势分布，红色区域为正电分布，蓝色区域为负电分布。由于去质子化的华法林为阴离子体系，无法直接计算静电势，在去质子处取代一个钠离子形成的华法林（）与华法林（）电荷分布类似。从图可以看出，华法林在与血清蛋白结合前的静电势分布都比较符合化学直觉，苯环与六元环上氢原子附近等值面上的静电势为正值，大小相似。氧原子附近等值面上的静电势为负值，香豆素一个环上有三个氧原子，电子分布更加集中在这个环上。当处于去质子化的过渡态时，正电集中在去质光谱学与光谱分析第 卷子处，其对位处的氧原子的静电势负值和范围增大。当华法林与血清蛋白结合后，其静电势分布发生明显变化，香豆素环部分整体平面呈正电分布，华法林另一侧静电势显负电。对比结合前后华法林表面静电势的变化，华法林是通过静电相互作用与血清蛋白进行结合的。图三种华法林结构的 图 紫外可见吸收光谱计算三种状态的 华 法 林得到 的 紫 外可 见 吸 收光 谱 如图所示，三种分子的吸收光谱均存在两个吸收峰，出现双吸收峰的主要原因是由于数个激发态跃迁产生紫外可见吸收导致。范围内的吸收峰为华法林的主要吸收峰，华法林（）的吸收波长为 ，华法林（）吸收波图华法林不同状态的紫外可见吸收光谱 长最大，为 且吸收峰强度最高，华法林（）相比于华法林（），波长红移 ，强度降低。未去质子化状态或酸性条件下，华法林还未与血清蛋白开始结合，吸收强度较高。在溶液中去质子化而脱去一个原子后，吸收峰波长红移，吸收强度降低。当华法林与人血清蛋白结合后，吸收波长红移，显示出吸收增强的现象，结合后结构发生变化，华法林整体的刚性平面增强导致吸收波长红移，吸收增强。为探究华法林不同状态紫外可见吸收光谱产生变化的原因，对主吸收峰的激发态进行了电子空穴分析。三种状态的主吸收峰均是由 的激发过程产生，从图中可以明显看出，华法林（）的电子与空穴为主要分布在香豆素环上的局域激发。去质子化后空穴更集中地分布在香豆素环右侧，电子分布在左侧，激发过程有一部分电子发生了转移，空穴整体已有向苯环转移的趋势。与血清蛋白结合后，整体结构发生扭曲，空穴从香豆素环上激发后完全转移到了苯环，激发过程也从局域激发变成了电荷转移激发。通过电子空穴分析得到华法林不同状态下激发过程的电荷转移情况，根据图可以看出紫外可见吸收光谱发生变化的原因主要是由于结构变化导致华法林激发过程的变化。图华法林主峰激发态的电子空穴分析图绿色为电子分布，蓝色为空穴分布 ，第期 唐妍等：华法林与人血清蛋白结合的动力学过程和光谱性能研究 荧光光谱通过波函数分析华法林激发态基态退激过程的分子前线轨道，其发射过程为分子的最低未占据分子轨道最高占据分子轨道（）轨道的跃迁产生。图中三种状态华法林的 轨道均分布在香豆素环附近，轨道跃迁类型为跃迁，华法林（）的 轨道都均匀分布在了香豆素环附近；华法林与血清蛋白结合的整个过程中，荧光发射过程的轨道跃迁与吸收过程类似，华法林（）在退激过程中电子云主要集中于去质子的六元环处；与血清蛋白结合后，轨道上的电子云除了分布在香豆素环上外，还有一部分移动到了苯环上。电子云分布的变化影响荧光发射过程，通过 理论计算过程的激发能与振子强度，模拟华法林不同状态的荧光光谱。图华法林荧光发射过程的分子前线轨道图 图华法林不同状态的荧光光谱 由表可知，华法林（）荧光峰波长为 ，去质子化后红移至 ，振子强度由 降至 。构型变化导致发射能降低，波长红移，振子强度降低，计算结果与 团队的模拟相吻合，去质子化华法林的计算荧光光谱与华法林水溶液的荧光光谱实验结果同样吻合。当华法林与血清蛋白结合后，相较于华法林（）产生荧光增益，荧光峰波长基本无变化而荧光强度增强。分析华法林发射过程的电荷转移来解释不同状态华法林荧光光谱变化的原因。表不同状态华法林的计算光谱数据 （）（）（）（）激发态电荷转移的定量描述定义了几种指数：指数代表分子激发过程中电子与空穴的重叠程度（上限为）；光谱学与光谱分析第 卷指数表示电子与空穴分布质心之间的距离；指数用于衡量电子与空穴的分离程度，指数大于表示电子与空穴较为分离，小于表示没有显著分离，通过考虑三种指数来定量描述激发过程的电荷转移。从图中分子前线轨道分布和表中数据可以看出，华法林（）总体表现为标准的局域激发，华法林（）从表中数据判断存在电荷转移，但通过轨道图可以看出只是部分电子云集中于一个环上产生的电子与空穴的分离，电荷并未转移出香豆素环外。与血清蛋白结合后，电子和空穴产生分离，从轨道图中也可看出部分电子云转移到了香豆素环外的苯环上。表不同状态华法林的电荷转移参数 （）（）（）以上的计算解释了华法林在不同状态下的发射过程，可以理解为 的轨道跃迁，分子轨道和电荷转移分析为这些荧光光谱的差异提供了进一步的理论支持。结论通过研究华法林分子与人血清蛋白结合前后的整个动力学过程，并计算不同状态的静电势来分析华法林的结合方式和电子密度分布。通过 理论模拟得到华法林分子在不同状态的紫外可见吸收光谱和荧光光谱，研究动力学过程和光谱性能，得出如下结论：模拟分析不同状态的静电势，结合后静电势整体发生较大变化，说明两者主要通过静电作用结合。华法林在水溶液中紫外可见吸收光谱表现出双吸收现象，主要由不同的激发态跃迁导致。未去质子化前，主要吸收峰波长为 ，去质子化后，吸收强度降低，波长红移，当华法林与血清蛋白结合后发生电荷转移导致吸收增益。通过计算的结构和激发能模拟华法林不同状态的荧光光谱，最初状态下荧光峰为 ，去质子化后，荧光强度降低，波长红移，结合后结构变化导致荧光增益。华法林在整个动力学过程中存在不同的荧光发射过程，结合后的荧光增益特征使华法林可以作为荧光探针。针对华法林反应前后电子跃迁、辐射过程，进行了分子前线轨道分析和电子空穴分析，可以看出结构的变化导致了不同的电子空穴分布和不同的 轨道，使得其发射光谱发生很大变化。综上，利用 理论和分子动力学模拟研究华法林与人血清蛋白结合的动力学过程，模拟了整个过程中华法林三种状态的紫外可见吸收光谱和荧光光谱。利用波函数分析解释了光谱变化的原因，揭示了华法林吸收与荧光光谱的变化机理，为探究分子动力学过程提供了更多的研究手段和理