不同长度糖链对α-乳白蛋白...(26)结构和致敏性的影响_熊子豪.pdf

熊子豪，王阳，任韵洁，等.不同长度糖链对-乳白蛋白过敏表位13KDLKGYGGVSLPEW26结构和致敏性的影响 J.食品工业科技，2023，44（14）：7480.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022090110XIONG Zihao,WANG Yang,REN Yunjie,et al.Effects of Different Lengths Sugar Chains on the Structure and Allergenicity ofAllergic Epitopes 13KDLKGYGGVSLPEW26 in-LactalbuminJ.Science and Technology of Food Industry,2023,44(14):7480.(inChinese with English abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022090110 研究与探讨 不同长度糖链对不同长度糖链对-乳白蛋白过敏表位乳白蛋白过敏表位13KDLKGYGGVSLPEW26结构和致敏性的影响结构和致敏性的影响熊子豪1，王阳1，任韵洁1，邹琳1，邵艳红1，刘俊1,*，涂宗财1,2（1.江西师范大学生命科学学院，国家淡水鱼加工技术研发专业中心，江西南昌 330022；2.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌 330047）摘要：-乳白蛋白的过敏表位是影响其致敏性强弱的分子基础，本文研究不同长度的糖链对其过敏表位结构和致敏性的影响。先合成-乳白蛋白的 IgE 线性过敏表位（13KDLKGYGGVSLPEW26，13K-W26），选用葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽五糖对其进行糖基化修饰，采用光谱、色谱分析其结构的变化；运用 ELISA 和细胞实验等方法来评价其 IgE 结合能力和 KU812 细胞释放组胺、白介素-4 和白介素-6 的能力。结果表明：不同长度的糖链与13K-W26发生糖基化反应后，降低其游离氨基含量，改变其荧光强度和紫外吸收强度，同时降低其 IgE 结合能力和KU812 细胞中组胺、白介素-4 和白介素-6 的释放能力。因此，不同长度的糖链能改变13K-W26的结构，降低其致敏性，顺序为麦芽五糖麦芽三糖麦芽糖葡萄糖。糖链可遮蔽-乳白蛋白的线性表位13K-W26，糖链越长，遮蔽作用越强，致敏性消减效果越好。关键词：-乳白蛋白，IgE 线性过敏表位，糖基化，致敏性本文网刊:中图分类号：TS252.1 文献标识码：A 文章编号：10020306（2023）14007407DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022090110EffectsofDifferentLengthsSugarChainsontheStructureandAllergenicityofAllergicEpitopes13KDLKGYGGVSLPEW26in-LactalbuminXIONGZihao1，WANGYang1，RENYunjie1，ZOULin1，SHAOYanhong1，LIUJun1,*，TUZongcai1,2（1.National R&D Center for Freshwater Fish Processing,College of Life Science,Jiangxi Normal University,Nanchang 330022,China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China）Abstract：The allergic epitopes of-lactalbumin are the molecular basis for allergenicity.In this paper,the effects ofdifferent lengths sugar chains on the structure and allergenicity of allergic epitopes in-lactalbumin were investigated.TheIgE linear epitopes of 13KDLKGYGGVSLPEW26(13K-W26)were synthesized and glycated with glucose,maltose,maltotriose and maltopentaose.Then the structural changes were analyzed by spectroscopy and chromatography.Cellularassays and ELISA were used to evaluate the histamine,interleukin-4 and interleukin-6 release ability of KU812 cells andthe IgE binding ability.The results showed that 13K-W26 was glycated by different lengths sugar chains significantly 收稿日期：20220913 基金项目：国家自然科学基金地区项目（31960457）；江西省自然科学青年基金项目（20202BABL215027）；江西省技术创新引导类计划项目（20212AEI91001）。作者简介：熊子豪（2000），男，硕士研究生，研究方向：食品营养组分相互作用，E-mail：xiongzihao_。*通信作者：刘俊（1989），男，博士，副教授，研究方向：食品营养组分相互作用，E-mail：lj_。第 44 卷 第 14 期食品工业科技Vol.44 No.142023 年 7 月Science and Technology of Food IndustryJul.2023 decreased the free amino content and changed the fluorescence intensity and UV absorption intensity,and decreased the IgEbinding ability and the release ability of histamine,interleukin-4 and interleukin-6 in KU812 cells.Therefore,differentlengths of sugar chains can change the structure of 13K-W26,and reduce the allergenicity.The order was maltopentaosemaltotriosemaltoseglucose.In conclusion,the sugar chains could mask the linear epitopes 13K-W26 of-lactalbumin,thesugar chains with longer length had stronger masking effects on epitopes,the better the effect of reducing the allergenicity.Keywords：-lactalbumin；IgE linear epitopes；glycation；allergenicity 牛乳中-乳白蛋白（-Lactalbumin,-La）含有人体必需氨基酸，可在人乳短缺时作为替代补充婴幼儿营养，但其会引发较为严重的过敏反应，严重危害人体的安全，从而限制了其作为营养补给的使用13。-La 是一种球形蛋白，分子量约为 14.4 kDa，主要有 123 个氨基酸组成，在其分子表面有着许多的过敏表位4，包含线性表位和构象表位，其中 IgE 线性过敏表位有 AA1-16、AA13-26、AA47-58、AA93-102 等，13KDLKGYGGVSLPEW26作为-乳白蛋白中的线性表位之一，与该蛋白中其他线性表位相比具有较强的 IgE 结合能力，能够被多数过敏患者的IgE 抗体所识别56。且该线性表位上存在 K13 和K16 两个糖基化位点7，以该表位为例来研究糖链长度对线性过敏表位结构和致敏性的影响是一个较好的选择。如何掩蔽或破坏这些过敏表位从而降低-La致敏性是当前研究的热点和难点。热处理、超声处理、辐射技术及化学修饰等方式会破坏-La 的结构，从而降低其致敏性89。糖基化反应可用来掩蔽或破坏-La 的线性和构象表位，是目前较为常用的一种脱敏手段10。范金波等11发现-La 被不同长度的糖链修饰后，降低其抗原性，糖链的长度与抗原性的降低成正相关；卜单等12研究发现超声处理的-La 与不同还原糖进行糖基化反应后能够影响蛋白的结构和抗氧化活性；Zhang 等13研究表明不同分子尺寸的糖与虾原肌球蛋白糖基化反应后可不同程度地降低其致敏性；芦晶等14用壳聚糖修饰乳清蛋白后，能显著改善其功能性质。陈文美等15研究发现通过半乳糖和焦磷酸钠先后对小清蛋白进行共价修饰，能够显著降低其致敏性。王亚婷16研究发现不同的二糖与卵清蛋白进行糖基化反应后，能够不同程度地改变其致敏性，且降低致敏性的程度与二糖的种类有关。这些研究表明不同的糖与蛋白质共价相互作用，能够改变蛋白质结构和功能特性，但是采用不同长度的糖链如麦芽糖、麦芽三糖和麦芽五糖这些以葡萄糖为单体的糖链对-La 分子中的过敏表位结构和致敏性的影响鲜有报道。因此，本论文以-La 的 IgE 线性过敏表位13KDLKGYGGVSLPEW26为研究对象，选用葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖和麦芽五糖对其进行糖基化修饰，采用光谱、色谱等技术研究糖基化修饰前后13K-W26结构的变化；运用酶联免疫吸附试验（enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA）和 KU812 细胞实验研究糖基化修饰前后13K-W26致敏性的变化，对过敏蛋白线性表位结构和致敏性的研究对消减整体蛋白质的致敏性有着重要意义。1材料与方法 1.1材料和仪器肽段13KDLKGYGGVSLPEW26（13K-W26）购自生工生物工程上海股份有限公司；葡萄糖、麦芽糖北京索莱宝科技有限公司；麦芽三糖、麦芽五糖上海源叶生物科技有限公司；山羊抗人 IgE-辣根过氧化物酶美国 Sigma 公司；牛奶过敏患者血清（相关信息见表 1）美国 Plasma Lab International 公司；ELISA 试剂盒深圳欣博盛生物科技有限公司；其余常用试剂均为分析纯。Synergy H1 型酶标仪美国伯腾仪器有限公司；F-7000 型荧光光谱仪、U-2910 型紫外可见光分光光度计日本 Hitachi 公司；Nicolet 6700 型傅里叶变换红外光谱仪美国热电（尼高利）公司。表 1 牛乳过敏患者信息Table 1 Information of milk allergic patients血清编号IgE水平年龄性别临床症状PL 2190216.4 kUL134男过敏性鼻炎、食物过敏PL 270914.38 kUL129女过敏性鼻炎PL 2665511.6 kUL135男过敏性鼻炎 1.2实验方法 1.2.1 样品制备参照 Liu 等17方法，制备 1.0 mg/mL的13K-W26溶液，称取等质量的葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽五糖，分别溶于 5 mL13K-W26溶液中，混均，冻干后，置于 55 和 65%相对湿度的培养箱中糖基化反应 2 h，将13K-W26经葡萄糖（Glucose,G）、麦芽糖（Maltose,M）、麦芽三糖（Maltotriose,MTS）和麦芽五糖（Maltopentaose,MPS）糖基化后的样品