表面增强拉曼光谱技术在多元病原菌同时检测中的应用策略_赵堉文.pdf

第 卷，第期 光谱学与光谱分析 ，年月 ，表面增强拉曼光谱技术在多元病原菌同时检测中的应用策略赵堉文，张泽帅，朱晓英，王海霞，李正，卢红委，奚萌天津中医药大学中药制药工程学院，天津 省部共建组分中药国家重点实验室，天津 扬子江药业集团江苏龙凤堂中药有限公司，江苏 泰州 摘要水、空气、食品、灰尘和排泄物中广泛存在食源性病原菌，由此引发的感染性疾病严重危害人类健康。因此，开发病原菌的快速检测方法尤为必要。由于实际样品中的病原菌往往共生存在，所以多元病原菌的同步灵敏检测是微生物检测领域的重点与难点。分子生物学和免疫组化分析技术都在此领域进行过一些尝试，但由于引物设计与抗体的局限性，这两种技术在实际应用中的效果并不十分理想。表面增强拉曼光谱（）技术由于具有快速、无损、高分辨率、不受水分干扰、可原位检测等显著优势，在多元病原菌同步检测领域获得了重要应用。从应用原理、特点和效果等方面出发，系统阐述了 技术在多元病原菌同时检测中的应用策略。首先对 基底材料与病原菌的结合方式进行简要概述，再以检测策略为主线，从直接法和间接法两种策略出发进行介绍。直接法通过基底材料的信号放大作用直接获得病原菌本身的光谱信息，步骤简便，操作快捷，在多元病原菌判别分析、定量分析与即时检测（）中被广泛应用。但由于光谱信息量大，往往需要与多元统计分析方法、成像技术和微流控器件等联用。间接法一般需要借助拉曼信号分子和适配体、抗体等识别元件，将对病原菌的检测转换为对信号分子的分析，极大提高了检测方法的灵敏度与特异性，可在基因、蛋白、细胞等水平实现对多元病原菌的同步分析。且与其他识别元件及功能分子的联用能构建得到集细菌的分离、识别与灭活于一体的综合检测体系，在临床血液等实际样本的分析中具有重要前景。最后，总结并指出 技术的现有问题及下一步努力方向，为 技术在多元病原菌的快速、灵敏检测策略设计及具体应用方面提供参考。关键词表面增强拉曼光谱（）；多元病原菌；鉴别分析；定量分析中图分类号：文献标识码：（）收稿日期：，修订日期：基金项目：科技部“重大新药创制”科技重大专项（），国家自然科学基金项目（）资助作者简介：赵堉文，年生，天津中医药大学中药制药工程学院博士研究生 ：通讯作者 ：引言食源性疾病是当前世界上比较突出的卫生问题，其中由食源性病原菌引发的感染性疾病呈高发态势，严重威胁人类健康。常见的食源性病原菌有葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌等，广泛寄生在水、空气、食品、灰尘和排泄物中。一般的细菌感染会引发呕吐、腹泻和发热，但是严重的会引发剧烈炎症，对于婴幼儿患者尤其危险，有时会危及生命。因此，探寻一种灵敏、准确、快速的实际样品中病原菌检测方法对于确保人体生命健康极为必要。实际样品中存在的食源性病原菌有浓度含量比较低，多种病原菌往往共生存在和病原菌相似性比较强三个主要特点。这三大特点给病原菌的检测方法提出了很高的要求，不仅要有高的灵敏度，而且还要有强的分辨率。针对病原菌检测，目前广泛应用的培养检测方法灵敏度比较低，且检测时间长，难以同时得到多种病原菌的检测结果。而实时聚合酶键式反应（）技术虽然可以做到高通量检测，但在引物设计的关键环节中由于 不能轻易区分相近菌属水平的菌种，导致该方法在相似菌种的分析上难以达到满意结果。酶联免疫吸附测定（）阵列分析在多元菌的检测中具有特异性识别优势，但是多种抗体共存容易引发交叉反应，从 而 影 响 抗 体 的 亲 和 力，进 一 步 影 响 多 元 菌 检 测结果。近年来，表 面 增 强 拉 曼 光 谱（，）技 术由于具有快速、无损、高 分辨率、可原位检测等显著特点，在多个检测领域都有应用。同样，分析技术在多元病原菌同时检测领域也有突出应用前景。本文首先介绍了 技术的检测原理和基底材料，然后从直接和间接两种检测策略上介绍了 技术在多元病原菌同时检测中的重要应用，包括对多元病原菌的定性和定量分析，以及 分析技术在即时检测（，）中的应用等。基底材料及与病原菌的结合 技术一般是基于金属表面的等离子体共振激发活性基底的局域电场产生“热点”，从而使拉曼信号放大 倍的光谱分析技术，如图所示，当待测物位于增强电场区域时，由于产生 效应，可放大光谱信号。该技术克服了普通拉曼光谱信号弱的缺点，且根据光谱峰与入射光能量发生的频率位移，可得到待测物质的高分辨特征指纹图谱，具有高灵敏度，高分辨率，高精密度的特点。图 检测原理示意图 活性金属基底材料的选择对 的产生至关重要。金和银两种金属的增强效果最好，是最为常用的基底材料，另外，从基底材料的存在形态上一般分为液态与固态基底两大类。液态基底一般指金、银等金属纳米溶胶，当病原菌与金属纳米溶胶接触后，产生的热运动使得纳米溶胶发生一定程度的聚集而形成 “热点”，从而便于病原菌的高灵敏检测。金属纳米溶胶制备方法成熟、灵活可控，应用十分广泛，但由于金属纳米溶胶运动的无序性，对测试结果的重现性往往有一定程度的影响。固态基底通过将金属纳米颗粒规则排列以提高检测信号的稳定性，可以将金属纳米颗粒直接固定在固态基板上，也可以通过一定的制造技术在固态基板上构建特定纳米结构而获得。除了活性基底材料的选择，技术对病原菌的检测还需要考虑的另一个重点问题就是如何将 基底材料与待测病原菌结合，从而形成有效检测“热点”，即检测策略的设计问题。技术对多元病原菌的检测策略一般可分为直接型和间接型两种。直接型包括两种作用形式，一种是通过静电引力等相互作用力直接将病原菌与基底材料结合（），另外一种是在病原菌表面原位还原生长纳米粒子（），从而形成检测“热点”。而间接法是基于适配体、抗体、抗菌肽等识别元件对病原菌的特异性识别作用，再辅助结合拉曼信标分子，通过采集拉曼信号分子的光谱信息从而间接实现待测病原菌的灵敏检测。图 技术对多元病原菌的检测策略示意图 直接法在多元病原菌同时检测中的应用如图所示，直接型检测是指在稳定且均一的 活性基底上直接获得病原菌特征拉曼光谱信号的检测方法。这种检测策略反映的是不同病原菌本身的拉曼光谱信息，谱峰重叠比较严重，这为进一步的谱图分析提出了更高的要求。直接法在多元病原菌判别分析中的应用判别分析是对多元菌检测分析的第一步，也是最重要的一步，直接法在多元菌判别分析应用方面发挥了一定作用。等制备 了 一 种 由 金 纳 米 粒 子 包 被 的 二 氧 化 硅 活性基底，并获得了蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌种病原菌的 光谱。结果显示，这些病原菌的 谱图具有较优的信噪比和重现性，且不同病原菌的特征峰位也显示出较大差异。研究表明直接将不同病原菌置于 “热点”区域的检测策略在不同病原菌的判别分析上有一定应用效果，但是，由于病原菌细胞壁组成成分的相似性，仍存在不同病原菌拉曼谱图分辨率低的问题，尤其是在同源病原菌的鉴别分析上这个问题更明显。因此，为了进一步提高对病原菌拉曼谱图的分析精度，很多研究者都引入了统计分析方法进行辅助分析。统计分析技术是一种有力的数据分析工具，它不仅可以方便筛查异常光谱，也可以降低分析数据的维度，从而利于提取更有 效 的 信 息 用 于 多 元 菌 的 判 别 分 析。主 成 分 分 析（）、偏最小二乘判别分析（）、线性判别 分析（）、层次聚类分析（）、典型变量分析（）等都是常用的统计分析方法。等以球型金纳米粒子为 增强材料，如图（）所示，通过纳米粒子在细菌表面的聚集获得了枯草芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌和大肠杆菌的 谱，首先对三种菌的谱图进行了 分析，如图（）所示，区分效果十分可观，前两个主成分可以代表绝大部分的光谱差异。为进一第期 赵堉文等：表面增强拉曼光谱技术在多元病原菌同时检测中的应用策略步确定引起光谱之间差异的变量，如图（）所示，使用 确定出对模型贡献的最大变量，并成功区分了结构相似的三种病原菌。等以纳米银棒阵列基板作为固态 检测基底，结合 方法对大肠杆菌与沙门氏菌的拉曼谱图进行判别分析，分类结果比较显著。该课题组进一步针对实际样本中不同浓度的致病菌和非致病菌，采用 和 方法对不同浓度含量的细菌混合菌液进行分析，结果表明这两种方法可以成功区分不同含量的病原菌。等 制备了一种黑磷纳米金滤纸复合基底用于区分三种食源性病原菌，直接将含菌样品滴在滤纸表面，即可在 激发波长下获得高强度的拉曼谱。并采用 与 方法对沙门氏菌、单核细胞增李斯特菌和大肠杆菌三种病原菌进行快速判别分析，鉴别准确率达 ，整个过程仅仅需要几分钟。图（）三种病原菌的 谱图；（）三种病原菌 谱图的 得分图；（）三种病原菌 谱图的 三维得分图 （）；（）；（）除了在不同菌属水平上的鉴别分析，直接法与统计分析技术的有机结合也可以实现不同血清型同源菌株精密分析。等 以金银纳米复合基板作为 基底，结合 技术实现了不同血清型单增李斯特菌的区分，证明了 技术在区分不同血清型菌株方面的应用潜力。类似地，等 又通过物理气相沉积技术将金属银均匀溅射到硅晶片上制得固态 检测基底，结合 分析技术可以用 于种不 同链 球菌属 的 快 速 鉴 别 分 析，分 离 度 可达。直接法在多元病原菌定量分析中的应用在多元菌的检测分析中，除了判别分析，定量分析也是重要方面。但多元病原菌的拉曼光谱往往重叠严重，研究中普遍采用“”技术用于多元菌定量分析。这种技术是指在自定义区域内自动收集数十条到数百条拉曼光谱，然后根据指定峰位的强度值进行积分从而用于定量分析。等 首先通过静电吸附作用将 聚集在病原菌周围，然后通过原位还原法直接在病原菌表面包裹纳米银粒子生成检测“热点”如图（）所示。这一设计使得病原菌的拉曼光谱信号急剧升高，运用 技术可以实现三种大肠杆菌和一种葡萄球菌的快速区分。更为重要的是，通过“”成像分析技术，可以将此方法用于饮用水中大肠杆菌的定量检测 如图（）所示，线性分析范围 为 。此外，等 使用树突状的银纳米基板作为 活性检测基底，结合 与“”成像技术可以用于沙门氏菌和大肠杆菌的同步检测，检测限为 。等 制备了一种稳定性好，重现性高的多功能 检测硅片。该硅片首先通过氟化氢刻蚀技术使硅片表面产生大量氢键，再将其置入 溶液中，通过还原氢键从而原位生长于硅片上，再通过 共价作用将 修饰于硅片上从而制得 检测芯片。该芯片集捕获、检测和杀灭细菌功能于一体，在以 为特征峰位的“”成像中可以清楚看到拉曼信号强度随细菌浓度的变化关系。该方法的线性分析范围为 ，并可用于血液样本中大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的分析检测，显示出良好的应用前景。图（）细菌表面原位合成纳米颗粒示意图；（）不同浓度大肠杆菌的 “”成像图 （）；（）“”直接法在 中的初步应用基于 分析的直接检测法不仅在传感器领域获得多种尝试和应用，近年来在分子器件领域也被广泛开发和用于实际样本检测。通过与微阵列芯片、微流控芯片等器件的联用，直接检测法在临床样本的即时定性和定量分析方光谱学与光谱分析第 卷面显示出良好的应用效果，有望用于 分析。等 将微流控系统与 检测联用，用于水中多种病原菌的检测。首先制备抗体固定化的聚乙二醇涂层芯片，然后将此芯片组装到流通池中，将待测含菌样品导入流通池中并静置 ，再匀速泵入纳米银溶液用于与病原菌结合，可以在流动状态下捕捉到大肠杆菌的拉曼光谱信息并用于定量分析，线性范围为 。该技术可同时添加针对多种病原菌的识别抗体，做到对多种病原菌的同时检测。等 开发了另外一种微流控检测平台，并结合判别分析模型，用于对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、铜绿假单胞菌、单增李斯特菌、无害李斯特菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 这种病原菌的快速分析。此芯片首先通过紫外线光固化技术在晶片表面沉积一层 的光刻胶制成母模，然后在母模的基础上通过软光刻技术制成聚二甲基硅氧烷（）芯片，将固化的 复制品从母模上剥离，冲压以形成入口和出口，之后粘合到载玻片即制得微流体芯片。待测菌液与纳米银溶胶分别由各自的入口泵入，待纳米银和 的混合液与病原菌作用后进行拉曼检测，这种检测芯片可区分种不同的食源性病原菌，在食品行业中应用前景广阔。间接法在多元病原菌同时检测中的应用如图所示，间接法一般