斑点叉尾鮰EGFL9基因变异位点与生长性状的关联分析.pdf

张文平，张世勇，刘洪岩，等.斑点叉尾鮰 EGFL9 基因变异位点与生长性状的关联分析J.福建农业学报，2023，38（3）：253261.ZHANGWP,ZHANGSY,LIUHY,etal.VariationSitesonEGFL9AssociatedwithGrowthofChannelCatfishJ.Fujian Journal of AgriculturalSciences，2023，38（3）：253261.斑点叉尾鮰 EGFL9 基因变异位点与生长性状的关联分析张文平1，张世勇2,3*，刘洪岩2,3，徐思琪2,3，王明华2,3，钟立强2,3，边文冀2,3，朱明1，陈校辉1,2,3*（1.江苏海洋大学海洋科学与水产学院，江苏连云港222005；2.江苏省淡水水产研究所，江苏南京210017；3.江苏省农业种质资源保护与利用平台，江苏南京210014）摘要：【目的】研究斑点叉尾鮰表皮生长因子样结构域蛋白 EGFL9（Multipleepidermalgrowthfactor-likedomainsprotein9）基因与其生长性状的相关性，为斑点叉尾鮰的分子标记辅助育种奠定基础。【方法】采用靶向基因测序技术对 EGFL9 基因进行测序，与参考基因组比对后筛选变异位点，并将获得的变异位点与生长性状进行关联分析。【结果】在 EGFL9 上共发现 27 个多态位点，经过滤，获得 22 个有效突变位点，其中 4 个变异位点（g.142、g.573、g.3079、g.7409）对斑点叉尾鮰的生长性状具有显著影响，位点 g.142、g.3079、g.7409 位于内含子中，位点g.573 位于第 2 外显子上；g.142 位点的 A/A 型个体的平均体长显著高于 A/G 型个体（P0.05）；g.7409 位点 A/G 型个体的平均体长显著高于 G/G 型、A/A 型个体（P0.05）；g.3079 位点 C/C 型个体的平均体质量和体长均显著高于A/A 型个体（P0.05）；位于外显子上的 InDel 位点 g.573 使 EGFL9 基因编码蛋白减少了一个苏氨酸残基，对蛋白质三级结构产生较为明显的影响，该位点 TACC/T 型个体的平均体质量显著高于 TACC/TACC 型个体（P0.05），平均体长显著高于 TACC/TACC 型与 T/T 型个体（P0.05）。【结论】获得的 4 个斑点叉尾鮰生长相关标记（g.142、g.573、g.3079、g.7409）与其生长性状显著关联，可以应用于后续斑点叉尾鮰育种芯片开发和分子标记辅助育种。关键词：斑点叉尾鮰；EGFL9；SNP；生长性状；关联分析中图分类号：S965文献标志码：A文章编号：1008-0384（2023）03025309Variation Sites on EGFL9 Associated with Growth of Channel CatfishZHANGWenping1,ZHANGShiyong2,3*,LIUHongyan2,3,XUSiqi2,3,WANGMinghua2,3,ZHONGLiqiang2,3,BIANWenji2,3,ZHUMing1,CHENXiaohui1,2,3*（1.School of Marine Science and Fisheries,Jiangsu Ocean University,Lianyungang,Jiangsu222005,China;2.FreshwaterFisheries Research Institute of Jiangsu Province,Nanjing,Jiangsu210017,China;3.Jiangsu Provincial Platform forConservation and Utilization of Agricultural Germplasm,Nanjing,Jiangsu210014,China）Abstract:【Objective】Correlationbetweenthevariationsitesonthemultipleepidermalgrowthfactor-likedomainsprotein9gene(EGFL9)andthegrowthofIctalures punctatuswasinvestigated.【Method】ThetargetedgenesequencingofEGFL9wasperformedtoidentifythevariationsitesbyalignmentwiththereferencegenome.Correlationbetweenthesitesandthegrowthtraitsofthefishwasstatisticallyanalyzed.【Result】Therewere27siteswithpolymorphicvariationsonEGFL9with22effectivemutationsobtainedafterfiltering.Amongwhich,4sites,i.e.,g.142,g.573,g.3079,andg.7409,weresignificantlyassociatedwiththegrowthtraitsofchannelcatfish.TheSNPsites,g.142,g.3079,andg.7409,wereinintrons,whiletheInDelsite,g.573,inexon2.ThemeanbodylengthofthefishwithA/Atypeatg.142wassignificantlylongerthanthatoffishwithA/Gtype(P0.05),whilethatofthefishwithA/Gtypeatg.7409significantlylongerthanthatoffishwithG/Gtype(P0.05).BothmeanbodymassandlengthofthefishwithC/Ctypeatg.3079weresignificantlygreaterthanthoseofthefish收稿日期：20221107初稿；20230308修改稿作者简介：张文平（1996），男，硕士研究生，主要从事鱼类遗传育种研究（E-mail：）*通信作者：张世勇（1987），男，博士，副研究员，主要从事鱼类遗传育种研究（E-mail：）；陈校辉（1977），男，硕士，研究员，主要从事鱼类遗传育种研究（E-mail:）基金项目：江苏省农业重大新品种创制项目（PZCZ201741）；国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-46）；江苏省现代农业产业技术体系建设项目 JATS(2022)413福建农业学报2023，38（3）：253261http:/Fujian Journal of Agricultural Sciencesdoi:10.19303/j.issn.1008-0384.2023.03.001withA/Atype(P0.05).TheInDelsite,g.573,reducedoneserineresidueintheproteinencodedbyEGFL9significantlyaltereedthetertiarystructure.Consequently,themeanbodymassofthefishwithTACC/TtypeatthissitewassignificantlyheavierthanthatofthefishwithTACC/TACCtype(P0.05),andthemeanbodylengthsignificantlylongerthanthatofthefishwithTACC/TACCorT/Ttype(P0.05).【Conclusion】The4growth-relatedmarkers,g.142,g.573,g.3079,andg.7409,revealedbythisstudyshowedsignificantassociationswiththegrowthtraitsofI.punctatus.Theinformationwouldpossiblyleadtothedevelopmentofbreedingchipsandmolecularmarker-assistedbreedingonchannelcatfishinthefuture.Key words:Ictalures punctatus；EGFL9；SNP；growthtraits；association0引言【研究意义】斑点叉尾鮰（Ictalures punctatus）是原产于北美洲的重要淡水经济鱼类1，于 1984 年引入我国，经过 30 多年的发展，我国已成为斑点叉尾鮰最重要的生产国和消费国2。由于种质资源受限，再加上国内斑点叉尾鮰繁育企业不规范的繁殖生产，21 世纪初期斑点叉尾鮰种质衰退现象愈发严重2。如何培养种质好、体质健康、生长速度快的斑点叉尾鮰苗种，是当下亟待解决的问题。因此，开展斑点叉尾鮰生长相关分子标记开发对其产业发展具有重大意义。【前人研究进展】表皮生长因子（Epidermalgrowthfactor，EGF）是一种由 53 个氨基酸和 3 个二硫键组成的耐热单链低分子多肽3，具有调控细胞生长发育的作用4，含有 EGF 样结构域的蛋白质被认为参与了神经系统的发育、维持和损伤反应等56。表皮生长因子样结构域蛋白（Epidermalgrowthfactor-likedomainsprotein，EGFL）的家族成员一般具有多个 EGF 结构样域，其多个家族成员被证明对于生物的生长和发育必不可少79，如 EGFL7的缺失会导致小鼠发育异常、生长缓慢10。本课题组前期在开展斑点叉尾鮰生长性状 QTL 定位研究过程中，在 28 号染色体上生长相关 QTL 区域内定位到一个重要的生长性状候选基因 EGFL911。EGFL9 基因编码的蛋白在脊椎动物中较为保守，是具有多个 EGF 样结构域的跨膜蛋白，在神经元和非神经元组织中表达，可以作为一种导向或信号分子发挥作用12。随着基因组测序技术的快速发展，多种测序技术在非模式动物中挖掘到大量变异位点，最常见的变异类型包括单核苷酸多态性位点（SNP）、插入/缺失（InDel）等。目前，SNP 分型方法较多，常见的有 Sanger 测序法、SNaPshot 法、PCR-LDR 连接酶检测法、KASP基因分型、高通量基因芯片以及重测序法等1314。靶向基因重测序技术是近年来兴起的一种新型的变异位点分型技术，其联合了多重 PCR 和高通量测序技术，从而实现对大样本和多位点分型，对已知变异位点序列和未知变异位点序列均具有很好的适用性。【本研究切入点】目前，鱼类中关于 EGFL9 基因的研究较少。本课题组的前期研究证明 EGFL9 基因是与斑点叉尾鮰生长性状相关的重要候选基因，但其显著关联分子标记有待于进一步挖掘。【拟解决的关键问题】本研究采用靶向基因重测序技术检测斑点叉尾鮰 EGFL9 基因的变异位点，并将筛选到的变异位点及其单倍型组合与其核心选育群体的生长性状进行关联分析，挖掘生长性状候选分子标记，以期为斑点叉尾鮰分子标记辅助育种奠定基础。1材料与方法1.1样品采集和 DNA 提取本研究使用的斑点叉尾鮰样本均采集于国家江苏斑点叉尾鮰遗传育种中心。2017 年 6 月，利用G1代鮰鱼亲本共生产 21 个 G2代家系，其中包括13 个全同胞家系和 8 个半同胞家系，家系选育及苗种培育过程详见课题组前期发表文献15。同塘养殖1.5 年后，从 G2核心选育群体中随机采集 201 尾斑点叉尾鮰个体，记录其体质量、体长和体高等生长参数，并采集尾鳍样品，保存于 95%乙醇中。使用DNA 提取试剂盒（Vazyme，中国）提取基因组 DNA，Qubit荧光