Th1_Th2平衡对寒凝血...神经生长因子及其受体的影响_翟凤婷.pdf

世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.博士论坛：基金项目：山东省自然科学基金资助项目（）；山东省中医药科技项目（）作者单位：山东中医药大学附属医院，山东 济南；山东中医药大学，山东 济南 通信作者：王东梅，：平衡对寒凝血瘀证原发性痛经大鼠神经生长因子及其受体的影响翟凤婷 王东梅 王丹丹 杨洁 曹卫平【摘要】目的 探究 型辅助性 细胞 型辅助性 细胞（，）平衡偏移对寒凝血瘀证原发性痛经（，）大鼠子宫组织神经生长因子（，）及其受体的影响，进一步揭示 的发病机制。方法将 只雌性大鼠，按随机数字表法分为空白组、模型组、偏移组、偏移组，每组各 只。建立寒凝血瘀证 大鼠模型，在此模型基础上建立 偏移 模型及 偏移 模型。比较各组大鼠扭体反应，检测各组大鼠子宫组织中神经生长因子（，）、酪氨酸激酶受体（，）及 营养因子受体（，）蛋白含量及 转录水平。结果 扭体潜伏时间：与模型组比较，偏移组和 偏移组，差异无统计学意义（）；偏移组较 偏移组缩短，差异有统计学意义（）。内扭体次数：与模型组比较，偏移组明显减少，差异有统计学意义（），偏移组明显增加，差异有统计学意义（）。与空白组比较，模型组大鼠、及 蛋白表达及 水平均升高，差异有统计学意义（，）；与模型组比较，偏移组、蛋白表达及 水平降低，差异有统计学意义（，），水平降低，差异有统计学意义（）；偏移组、及 蛋白表达及 水平均升高，差异有统计学意义（，）。结论 细胞平衡干预 及其受体表达可能是寒凝血瘀证 的发病机制之一。【关键词】原发性痛经；寒凝血瘀证；神经生长因子；酪氨酸激酶受体；营养因子受体【中图分类号】【文献标识码】，（，；，）【】（）（）（），（），（），（），（），（），（），（，），（，）（）；，（，）世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.【】；原发性痛经（，）是指行经前后或月经期出现下腹部疼痛、坠胀，常伴腰酸、恶心、呕吐、腹泻、出汗、疲劳和睡眠障碍等全身症状，而经妇科检查无生殖器官器质性病变的疾病，持续时间一般不超过 ，是最常见的妇科疼痛性疾病。好发于月经初潮后 年的青春期少女或尚未生育的年轻妇女。流行病学调查显示，不同国家 的发病率在 之间，国内 的发病率在 之间，其中中度占，重度占 ，严重影响女性正常的学习与工作，降低生活质量。的发病机制存在多种学说，但多数学者认为 的发病与前列腺素（，）有关。既往研究，证实，寒凝血瘀证 大鼠模型中前列腺素（，）升高，前列腺素（，）降低，同时存在 型辅助性 细胞（，）和 型辅助性 细胞（，）的偏移，说明 平衡偏移参与了寒凝血瘀证 的发生。神经生长因子（，）由传入神经支持细胞产生，对感觉神经元的生长、发育来说是不可或缺的，是导致疼痛敏感化的重要介质之一。等通过研究证实，在兔的子宫组织中，及其受体能够促进 的产生，其机制可能与其调控一氧化氮合酶（，）有关。生理状态下，、处于平衡状态，共同维持 表达处于正常水平，当、任何一方表达异常时，均可导致 表达异常。分泌的白细胞介素 （，）等细胞因子能诱导 的合成与分泌，而 分泌的细胞因子 干扰素（，）能拮抗这种作用。有研究认为 对 本身的表达并无明显影响，但可通过其分泌的白细胞介素（，）增强 受体酪氨酸激酶受体（，）的表达，从而放大 的生物效应。因此，进一步研究 平衡偏移对 影响的具体作用机制可能成为寻找治疗 有效方法的突破口。流行病学调查研究显示，寒凝血瘀证在 的中医证型分布中所占比例最高，因此，本研究以寒凝血瘀证 大鼠研究对象，为通过建立寒凝血瘀证 大鼠模型和、偏移 大鼠模型，法、法检测各组大鼠 及其受体水平，探讨 调控 表达在寒凝血瘀证 发病中的作用。材料与方法 材 料 动物及饲养条件 周龄、未交配、体质量 雌性 大 鼠 只，动 物 合 格 证 号：（鲁），购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，饲养于山东中医药大学附属医院动物实验中心，室温保持 ，相对湿度约 ，日光灯明暗各 模拟昼夜交替。本研究经山东中医药大学附属医院动物伦理委员会审核批准（审批号：）。药 物苯甲酸雌二醇注射液（宁波第二激素厂，规格：支，生产批号：）；缩宫素注射液（马鞍山丰原制药有限公司，规格：支，生产批号：）；细胞因子 （，规格：包，生产批号：）；细胞因子 （，规格：包，生产批号：）。试 剂大鼠脾脏淋巴细胞分离液试剂盒（，）、（）（，）、（，）、（，）、（，）、（，）、（，），、（北京博奥森生物技术有限公司）。仪 器 型流式细胞仪（美国 公司），型酶标仪（芬兰 公司）。方 法 分组与造模方法世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.实验大鼠进行 周的适应性饲养，采用按随机数字表法将其分为空白对照组、模型对照组、偏移组和 偏移组，每组各 只，分别用苦味酸标记。寒凝血瘀证 大鼠模型：采用寒冷刺激联合苯甲酸雌二醇以及缩宫素建立。具体方法参照本课题 组 前 期 研 究 造 模 方 法。偏 移 组 模型：自寒凝血瘀证 大鼠造模第 天起，腹腔注射 （），次，次，连续；空白组及模型组大鼠同时间腹腔注射生理盐水，次，次，连 续 。偏 移 组 模型：自寒凝血瘀证 大鼠造模第 天起，腹腔注射 （），次，次，连续。寒凝血瘀证造模验证指标：寒战，蜷缩少动，喜扎堆，呼吸弱，弓背竖毛，爪尾部紫暗，耳色暗红，毛色枯槁，舌质紫暗，舌下脉络增粗增长，粪质不成形。痛经造模验证指标：观察大鼠扭体反应，即大鼠腹部收缩内凹，躯干与后肢伸展，臀部与一侧肢体内旋。、偏移造模验证指标：流式细胞术分别检测各组大鼠脾脏 细胞及 细胞比例，以 细胞比值作为、平衡偏移验证造模指标。取材方法末次给药 后，腹腔注射 水合氯醛 麻醉。肉眼观察大鼠脾脏及子宫组织，摘取大鼠脾脏及子宫组织。观察指标 扭体反应注射缩宫素后，观察各组大鼠扭体反应潜伏时间及 内扭体次数。流式细胞术法检测各组大鼠脾脏 细胞、细胞比例取大鼠脾脏组织块称重后剪成小块，获取脾脏组织研磨液，离心 ，弃上清。样本稀释液调整细胞浓度为 ，加入淋巴细胞分离液获取淋巴细胞，以 细胞培养液调整淋巴细胞浓度为 ，每毫升细胞悬液中加入 （）。将细胞置于 的二氧化碳培养箱中培养，收集活化细胞。加入外标抗体 ，避光放置 。分别用固定液、穿膜液处理后将细胞重悬于 穿膜液中，加入内标抗体 和 ，避光。加入 穿膜液，以离心半径 ，转速离心 ，弃上清，清洗。加 重悬细胞。转管，上机检测。法检测大鼠子宫组织中、营养因子受体（，）蛋白含量取大鼠子宫组织约 ，剪成小块后置于研钵中，加入 及 ，随后加入少量液氮，将其研磨至匀浆状态，冰浴后以离心半径 ，转速离心 ，取上清，即为总蛋白溶液，用 蛋白定量测定法对蛋白总浓度进行测定。电泳、湿法转膜、封闭 ，稀释一抗（）孵育过夜。洗 遍，将膜放入稀释的二抗（）中，孵育 。用、配制显影液，并将膜浸泡至其中。软件分析灰度值。法检测大鼠子宫组织中、表达水平取大鼠子宫组织 剪成小块，提取子宫组织中总，逆转录为；取 管，配制如下反应体系为 ，基因引物 ，反转录产物 ，双蒸水，每个配制 管；温度预变性，同温变性 ，温度退火 ，温度延伸 ，重复 个循环。法分析数据。引物由武汉赛维尔生物科技有限公司合成。结果见表。表 引物序列信息表引物名称引物序列片段长度上游 下游 上游 下游 上游 下游 上游 下游 统计学方法采用 统计学软件分析数据，计量资料采用均数 标准差（）表示，各组间计量资料比较满足正态分布和方差齐，采用单因素方差分析（）；不符合应用条件采用秩和检验。以 表示差异有统计学意义。结 果 各组大鼠脾脏 细胞比值 细胞所占比例与 细胞所占比例做比值 世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.比较，由高到低分别为：空白组，偏移组，模型组，偏移组。各组间比较：与空白组比较，各组大鼠 细胞比值降低，差异有统计学意义（）；与模型组比较，偏移组 细胞比值升高，差异有统计学意义（），偏移组 细胞比值降低，差异有统计学意义（）。证实造模成功。结果见表。表 各组大鼠脾脏 细胞比值（）组 别 细胞比值空白组 模型组 偏移组 偏移组 注：与空白组比较，；与模型组比较，各组大鼠扭体潜伏时间及扭体次数比较扭体潜伏时间比较：与模型组比较，偏移组和 偏移组，差异无统计学意义（）；偏移组较 偏移组扭体潜伏时间缩短，差异有统计学意义（）。内扭体次数比较：与模型组比较，偏移组扭体次数明显减少，差异有统计学意义（），偏移组扭体次数明显增加，差异有统计学意义（）。结果见表。表 各组大鼠扭体潜伏时间及扭体次数比较（）组 别扭体潜伏时间（）扭体次数（次）模型组 偏移组 偏移组 注：与模型组比较，；与 偏移组比较，各组大鼠子宫组织中、蛋白水平比较与空 白 组 比 较，模 型 组 大 鼠、及 蛋白表达均升高，差异有统计学意义（，）。与模型组比较，偏移组、蛋白表达降低，差异有统计学意义（），蛋白表达亦降低，但差异无统计学意义（）；偏移组、及 蛋白表达均升高，差异有统计学意义（）。结果见表。表 各组大鼠子宫组织中、及 蛋白水平比较（）组 别空白组 模型组 偏移组 偏移组 注：与空白组比较，；与模型组比较，各组大鼠子宫组织中、转录水平比较与空白组比较，模型组大鼠、水平均明显升高，差异有统计学意义（）。与模型组比较，偏移组、水平均降低，差异有统计学意义（，），偏移组、水平均明显升高，差异有统计学意义（）。结果见表。表 各组大鼠子宫组织中、转录水平比较（）组 别 空白组模型组 偏移组 偏移组 注：与空白组比较，；与模型组比较，讨 论 是妇科最为常见的疼痛性疾病，其常见中医证型包括：气滞血瘀证、寒凝血瘀证、湿热蕴结证、肾气亏损证及气血虚弱证，其中又以寒凝血瘀证最为多见。然而，寒凝血瘀证 的发病机制目前仍不明确。研究表明，疼痛作为一种应激刺激，能够引起一系列的免疫反应，。同样，免疫功能的异常也会影响疼痛的发生。多项研究表明，免疫细胞产生的神经递质和细胞因子在痛觉调制过程中发挥重要作用，。近年来通过对 患者外周血淋巴细胞亚群的研究，发现神经 内分泌 免疫网络之间关系密切，患者存在免疫功能 异 常 的 情况。其中，又以 细胞与 的关系最为密切。细胞主要分泌白介素 （，）、白介素（，）、肿瘤坏死因子（，）等细胞因子，细胞主要分泌白介素（，）、白介素 （，）、白介素（，）、白介素（，）、白介素（，）等细胞因子。及 均能够作用于子宫内膜，增强子宫内膜 合成酶的活性，从而刺激内膜产生，调节 比值，引发。同时，能够刺激子宫内膜生成血栓烷类物质和白三烯。血栓烷类物质可抑制血小板内膜上的腺苷环化酶的活性，下调环磷酸腺苷的表达，并引起 内流，促进血小板的活化和聚集，进而形成血栓，引发痛经。而白三烯能够促进炎症细胞聚集在炎症局世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，.，.部，释放炎症介质，引发痛经类代谢产物。由 型细胞分泌，是免疫细胞信号传导的主要成分，也是整个免疫系统功能的关键调节蛋白，能够抑制 介导的机体炎症反应，并促使机体产生并释放一氧化氮（，）。是一种内皮源性舒张因子，具有多种生物学活性，能够扩张局部血管、舒张平滑肌、抑制血小板聚集并对抗 引起的血小板激活，防止血栓形成，从而缓解痛经症状。是最早发现的神经营养因子家族成员，包括脑源性神经营养因子、神经营养因子 和神经营养因子，具有促进交感神经元和感觉神经元分化成熟的作用。相关受体主要包括 和，与成熟的 结合后能激活神经营养信号，而 对 的前体 亲和力更高，二者结合后能激活神经营养和凋亡信号。随着研究的深入，发现 在各种急慢性疼痛的产生及痛觉过敏过程中起着重要作用，多项研究表明，在动物炎性和痛症模型中，的含量升高，。等证实，应用抗 抗体能够减轻神经病理性痛觉过敏及异常性疼痛；等表明 抗体能够减轻痛觉过敏。李光玲和张励才发现 信号通路介导了大鼠的神经病理性疼痛，经过注射 抗体可能通过减轻这种疼痛。由此可见，与疼痛的发生密切相关。在体内，通过下调，能够使 物质的合成显著减少，物质与相应受体结合后，能够增加血管的通透性，导致炎症反应及疼痛反应，而下调 后，物质合成减少，抑制了疼痛反应，故 与 的发生密切相关，。此外，有研究在基因水平证实了 与