肝片吸虫CatB9蛋白的分...征、遗传进化及表达定位研究_张凯.pdf

第4 4卷 第7期家畜生态学报V o l.4 4N o.72 0 2 3年7月A c t aE c o l o g i a eA n i m a l i sD o m a s t i c iJ u l.2 0 2 3肝片吸虫C a t B 9蛋白的分子特征、遗传进化及表达定位研究 收稿日期 2 0 2 1-0 7-0 7修改日期:2 0 2 1-1 0-2 1 基金项目 国家重点研发计划项目(2 0 1 7 Y F D 0 5 0 1 2 0 0);兵团国际科技合作项目(2 0 1 6 AH 0 0 6);新疆自治区研究生科研创新计划(X J 2 0 2 0 G 0 8 5)作者简介 张 凯(1 9 9 0-),男,河南驻马店人,博士研究生,主要从事动物寄生虫学研究。E-m a i l:2 9 0 2 8 7 4 7 3q q.c o m*通讯作者 孟庆玲(1 9 6 9-),女,江苏徐州人,博士,教授,主要从事动物寄生虫学研究。E-m a i l:x j m q l q j 1 6 3.c o m张 凯1,王熙凤1,孟庆玲1*,乔 军1,张国武1,宁程程1,李 娜1,才学鹏2(1.石河子大学 动物科技学院,新疆 石河子8 3 2 0 0 3;2.中国农业科学院 兰州兽医研究所,甘肃 兰州7 3 0 0 4 6)摘 要 为了解肝片吸虫(F a s c i o l ah e p a t i c a,F h)组织蛋白酶B 9(C a t B 9)的生物学功能,该研究对F hC a t B9基因进行克隆、表达,并对其免疫原性和在F h体内的定位进行分析。结果显示:F hC a t B9基因长度为10 3 8b p,编码3 4 5个氨基酸;编码的蛋白无跨膜区,有信号肽于第1 92 0氨基酸间。生物信息学分析显示,F hC a t B 9蛋白含2个N-糖基化位点、7个磷酸化位点、1 5个线性B细胞抗原表位和C a t B的保守结构域,高级结构显示与大鼠C a t B酶原相似。系统进化结果显示,F h和大片吸虫亲缘关系最近,与其他寄生虫亲缘关系较远。S D S-P AG E和W e s t e r nb l o t都在5 5.3k u处检出目的条带。免疫组化显示,C a t B 9在F h的肠道上皮细胞和排泄管上皮细胞均有表达,重组蛋白的获得为F h血清学检测试剂的研发提供了一个有潜在价值的候选抗原。关键词 肝片吸虫;组织蛋白酶B 9(C a t B9);原核表达;免疫原性 中图分类号 S 8 5 2.7 3+5 文献标识码 A 文章编号 1 0 0 5-5 2 2 8(2 0 2 3)0 7-0 0 7 2-0 7d o i:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 6 7 3-1 1 8 2.2 0 2 3.0 7.0 1 1 肝片吸虫(F a s c i o l ah e p a t i c a,F h)是一种人畜共患寄生虫,是人和动物肝片吸虫病的病原体,除人类感染外,还感染牛、羊等草食动物肝脏和肝胆,给畜牧业造成重大的经济损失1-2。F h遍布于世界各地,尤其是拉丁美洲、欧洲和非洲3,而在中国F h集中分布于黑龙江、吉林、辽宁、青海、甘肃、新疆及西藏等畜牧业比较发达的放牧区域,而在这些地区牛、羊的感染率最高为8 0%,严重妨碍这些地区畜牧业的发展4-9。所以,开展F h感染、致病机制及疫苗研究对于有效防控F h的流行具有重要意义。组织蛋白酶(C a t h e p s i n,C a t)为半胱氨酸蛋白酶家族的重要成员,在F h中大量表达,主要包括组织蛋 白 酶L(C a t L)和 组 织 蛋 白 酶B(C a t B)1 0。C a t B为F h合成的主要蛋白酶之一,大多在幼虫和新脱囊童虫时期合成1 1,该蛋白主要存在于F h的体表,可直接与宿主免疫系统接触,抑制宿主免疫反应,促进免疫逃避,此外还与F h囊蚴脱囊有关1 2。因此,C a t B对F h的成熟、寄生以及在宿主体内移行等众多过程中扮演着非常重要的角色1 3。C a t B 9是半胱氨酸家族中的重要成员之一,然而目前关于C a t B 9的生物学功能和致病机理尚未深入研究。本研究通过克隆和表达F hC a t B9基因,分析其分子特征和遗传进化,在此基础上,开展C a t B 9免疫原性和在F h体 内 表 达 定 位 研 究,不 仅 为 揭 示C a t B 9蛋白的生物学功能提供了理论依据,而且为研发F h血清学检测试剂供了有潜力的候选抗原。1 材料与方法1.1 试验材料F h虫体采集于乌鲁木齐市家畜屠宰场;5周龄大小的昆明鼠购于石河子大学实验动物中心;F h阳性血清由石河子大学预防兽医学实验室保存;质粒p E T-3 2 a(+)和p MD 1 9-T、感受态 细 胞E.c o l iDH 5、内切酶B a mHI和E c oRI、I P T G、T 4D NAL i g a s e以及c D NA合成试剂盒购自T a K a R a公司;2P C R M i x购于广州东盛生物科技有限公司;T r a n s e t t a(D E 3)感受态细胞、D NA m a r k e r、蛋白m a r k e r、HR P标记兔抗绵羊I g G以及HR P标记山羊抗鼠I g G购自北京全式金生物技术有限公司;硝酸纤维素膜购自北京博奥森生物技术有限公司。1.2 F hC a t B9基因R T-P C R扩增根据F h全基因组 及转录组 数 据 库,并 结 合G e n B a n k数据库 公布的F hC a t B9序 列(登 录 号B N 1 1 0 6_s 3 7 3 B 0 0 0 2 9 0),用P r e m i e r5设计C a t B9基因的特异性引 物,上游引 物:5 -C G GAT C C AT-GAG C T T A C T GAT C T C-3,下游引物:5 -G GAAT-T C T T AT T G G G G T AAT T T T G G-3,下 划 线 处 为B a mHI和E c oRI酶切位点。采用T R I z o l法提F h总R NA,并将R NA反转录合成c D NA,以合成的c D NA为模板通过R T-P C R对C a t B9基因进行扩增。扩增体系为2 0.0L,其中:P C R M i x1 0.0L,引物各0.5L,c D NA2.0L,d d H2O7.0L。扩增程序:预变性9 5 5m i n;变性9 5 4 0s,退火5 2.54 0s,延伸7 21m3 0s,3 5个循环;终延伸7 21 0m i n。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳验证并胶回收目的片段,将回收的片段与p MD 1 9-T载体相连,构建p MD-C a t B 9质粒,用P C R和双酶切验证后送北京睿博兴科生物技术有限公司测序。1.3 F hC a t B9基因及其编码蛋白分子特征分析使 用D NA S T A R和D NAMAN软 件 分 析C a t B9的序列;使用P r o t S c a l对C a t B 9蛋白序列的亲疏水性进行分析、使用P r o t P r a m对蛋白的基本理化性质进行预测、S i g n a l P预测该蛋白是否存在信号肽、TMHMM2.0对该蛋白是否有跨膜螺旋结构进行预测、M o t i f S c a n对该蛋白潜在的糖基化位点进行预测、I E D B对该蛋白B细胞线性表位进行预测、C D S分析该蛋白结构域、S O PMA对该蛋白二级结构进行预测、S w i s s-m o d e l对该蛋白高级结构进行预测;并用ME GA6.0软件将F hC a t B9序列与其他寄生虫序列构建进化树,比较其相似程度。1.4 p E T-C a t B 9原核表达载体的构建与鉴定用B a mHI和E c oRI快切酶双酶切p E T-3 2 a(+)表达载体和p MD-C a t B 9重组质粒,将酶切的片段进行胶回收并连接,连接体系1 0L:5L目的基因、3L载体片段、1LL i g a t i o nB u f f e r和1LT 4D NAL i g a s e,于4 过夜连接后转入感受态细胞E.c o l iDH 5,并进行P C R和双酶切验证重组表达质粒p E T-C a t B 9是否构建成功。1.5 F h重组蛋白C a t B 9的诱导、纯化及鉴定将构建成功的质粒p E T-C a t B 9转入感受态细胞T r a n s e t t a(D E 3)中,用P C R和双酶切进行验证,验证成功后接入2 0 0m L含氨苄青霉素的L B培养基中,待培养液O D6 0 0为0.60.8,在3 7I P T G终浓度为1mm o l/L的条件下诱导8h,每2h收集1.0m L,收集的菌液用1 20 0 0r/m i n转速离心2m i n收集菌体;并设置未诱导组和空载体p E T-3 2 a(+)转化菌的诱导组对照。用镍亲和层析法纯化表达蛋白,用S D S-P AG E分析重组蛋白的表达情况。以感染F h绵羊的阳性血清为一抗,HR P标记的兔抗绵羊I g G为二抗,用W e s t e r nb l o t法检测。1.6 F h C a t B 9蛋白免疫原性及表达定位分析将纯化的重组蛋白C a t B 9与弗氏佐剂完全乳化后在小鼠皮下进行多点注射,以制备出多克隆抗体血清。将F h重组蛋白作为包被抗原,用HR P标记的羊抗鼠I g G为二抗,用间接E L I S A法检测免疫后小鼠血清的抗体效价,并分析C a t B 9的免疫原性。将F h成虫制备成石蜡切片,用3%H2O2封闭内源性过氧化物酶,以制备的小鼠多克隆抗体血清(12 0 0稀释)为一抗、HR P标记的山羊抗鼠I g G(115 0 0稀释)为二抗,经D A B显色,苏木素复染,自来水蓝化,中性树胶封片后在显微镜下观察拍照。2 结果与分析2.1 F hC a t B9基因的克隆用提取的F h总R NA反转录合成的c D NA为模板,通过R T-P C R扩增出1条10 3 8b p的片段(图1 A),其大小与预期一致;构建的p MD-C a t B 9质粒双酶切后可得到26 9 2b p的载体片段和10 3 8b p的目的基因片段(图1 B),证明重组质粒构建成功。2.2 F hC a t B9基因和编码蛋白的分子特征分析F hC a t B9基因核苷酸序列与G e n B a n k中F hC a t B9的序列同源性为9 9.9 0%。其编码的蛋白具有亲水性,理论等电点(p I)为6.5 0,该蛋白没有跨膜区,信号肽的切割位点在第1 9和2 0个氨基酸之间,属于分泌型蛋白。M o t i fS c a n预测C a t B 9蛋白有2个N-糖基化位点,3个酪蛋白激酶磷酸化位点,4个蛋白激酶C磷酸化位点以及6个豆蔻酰化位点。I E D B结果显示,C a t B 9蛋白有1 5个B细胞线性抗原表位;C D S分析发现C a t B 9序列有保守的C a t B蛋 白 结 构 域;二 级 结 构 预 测C a t B 9蛋 白 由2 9.8 6%的-螺旋、6.9 6%的-折叠构、1 2.1 7的延伸连以及5 1.0 1%的无规则卷曲构成;三级结构预测F hC a t B 9蛋白与大鼠C a t B结构相似。37第7期 张 凯,等:肝片吸虫C a t B 9蛋白的分子特征、遗传进化及表达定位研究2.3 基于F hC a t B9基因的遗传进化分析用ME GA6.0软件将F hC a t B9核苷酸序列与其他寄生虫序列构建进化树,结果显示,F h和大片吸虫的亲缘关系最近,同源性9 7.3 9%,而与日本血吸虫、布氏姜片虫、宫崎(氏)并殖吸虫、中华支睾吸虫、裂体吸虫、曼氏血吸虫、毛毕吸虫和棘口吸虫等吸虫以及绦虫和蜱虫等其他寄生虫的亲缘性相对较远(图2)。图1 F hC a t B9基因的R T-P C R扩增