当归四逆汤的免疫调节作用验证_李思晓.pdf

第 24 卷 第 4 期北华大学学报(自然科学版)Vol24 No42023 年 7 月JOUNAL OF BEIHUA UNIVESITY(Natural Science)Jul2023文章编号:1009-4822(2023)04-0454-07DOI:1011713/jissn1009-4822202304006当归四逆汤的免疫调节作用验证李思晓，苑广信(北华大学药学院，吉林 吉林132013)摘要:目的探讨当归四逆汤对 D-gal 致衰老小鼠的免疫调节作用及作用机制方法以当归四逆汤为试材，采用高效液相色谱-质谱联用技术分析当归四逆汤的有效成分，并利用 PubChem 数据库和 Swiss Target Prediction 数据库筛选药物相关靶点;利用在线人类孟德尔遗传数据库和 Gene Cards 数据库筛选免疫相关疾病靶点;将当归四逆汤作用靶点与免疫相关靶点进行交集，利用 STING 数据库和 Cytoscape371 软件进行蛋白互作网络分析;利用 DAVID 平台进行 GO 功能分析和 KEGG 信号通路富集分析;应用 AutoDock 软件进行分子对接，PyMOL 进行结果可视化构建 D-gal 诱导的小鼠免疫衰老模型，检测小鼠血清中白介素 6(IL-6)、白介素 2(IL-2)、白介素 4(IL-4)、肿瘤坏死因子(TNF-)、干扰素(IFN-)的含量，计算脾脏指数，检测小鼠脾脏组织中 SOD、GSH-Px活性及 MDA、8-OHdG 含量结果经液质联用技术和网络药理学筛选后获得有效成分 20 个，靶点 371 个，免疫相关靶点 1 115 个;PPI 网络分析获得 TNF、IL6、VEGFA、MAPK3 等核心靶点;基因 GO 功能和 KEGG 通路富集分析发现当归四逆汤能够增强免疫功能，其主要是通过 TNF 信号通路、Pl3K 信号相关通路发挥协同调节作用本研究验证了当归四逆汤能显著降低 D-gal 诱导衰老小鼠血清中 TNF-、IL-6 含量，增加脾脏指数，提高 SOD、GSH-Px 活性，降低 MDA、8-OHdG 含量结论本研究运用液质联用方法、网络药理学和分子对接方法、动物试验方法预测了当归四逆汤增强免疫的潜在作用靶点和作用机制，并初步验证当归四逆汤对小鼠的免疫调节作用关键词:当归四逆汤;免疫;分子对接中图分类号:965文献标志码:A收稿日期:2022-09-07基金项目:吉林省科技发展计划项目(YDZJ202201ZYTS197)作者简介:李思晓(1995)，女，硕士研究生，主要从事药物分析学研究，E-mail:1073085922 qqcom;通信作者:苑广信(1981)，男，博士，教授，硕士生导师，主要从事食品及药品质量控制方法研究，E-mail:17287598 qqcomValidation of Immunomodulatory Effect on Danggui Sini DecoctionLI Sixiao，YUAN Guangxin(Pharmacy College of Beihua University，Jilin 132013，China)Abstract:ObjectiveTo study the immunomodulatory effects of Danggui Sini Decoction on D-gal induced agingmice，and to explore its mechanism MethodTaking Danggui Sini Decoction as test material，the activeconstituents of Danggui Sini Decoction were analyzed by high performance liquid chromatography-massspectrometry，and the drug related targets were screened by PubChem database and Swiss Target PredictiondatabaseImmune-related disease targets were screened by using online human Mendelian genetic database andGene Cards databaseThe targets of Danggui Sini Decoction were intersected with immune-related targets，andSTING database and Cytoscape371 software were used for protein interaction network analysisDAVID platformwas used for GO function analysis and KEGG signal path enrichment analysisAutoDock software was used formolecular docking，and PyMOL visualized the results The D-gal induced immune aging model of mice wasestablished，the contents of interleukin-6(IL-6)and tumor necrosis factor (TNF-)in serum of mice weredetected，the spleen index was calculated，SOD，GSH-Px activity，MDA and 8-OHdG content in spleen tissues ofmice were detected esults20 effective components，371 targets and 1 115 immune-related targets wereidentified by LMS and network pharmacologyThe core targets of TNF，IL6，VEGFA and MAPK3 were obtained byPPI network analysisThe enrichment analysis of gene GO function and KEGG pathway showed that Danggui Sinidecoction enhanced immune function mainly through synergistic regulation of TNF signaling pathway and Pl3Ksignaling related pathwayIn addition，Danggui Sini decoction can significantly reduce the contents of TNF-andIL-6 in serum of D-gal induced aging mice，increase spleen index，improve SOD activity，and reduce the contentsof MDA and 8-OHdGConclusionThe potential targets and mechanism of Danggui Sini Decoction to enhanceimmunity were predicted by using liquid-mass combination method，network pharmacology and molecular dockingmethod as well as animal experimental methods，and the immunomodulatory effect of Danggui Sini Decoction onmice was preliminarily verifiedKey words:Danggui Sini Decoction;immunity;molecular docking免疫衰老学说是由美国加利福尼亚大学病理学家 Walford 在 20 世纪 60 年代首先提出的，该学说认为免疫功能衰退从根本上决定了机体的衰老，由于免疫功能低下、自身抗体产生增多和长期低度组织相容反应等可引起疾病的发生发展，也容易导致衰老的产生1-4 伤寒论 中当归四逆汤(Danggui SiniDecoction，DSD)一方至今应用于临床，主治糖尿病周围神经病变5、雷诺综合征6、痛经7 等疾病，曾在 2018 年被国家中医药管理局纳入古代经典名方目录(第一批)8 免疫衰老会导致先天免疫系统如免疫细胞及相关细胞因子数量和功能变化，但很难有针对性的改善，服用传统中药提升自身免疫力成为大部分人的选择本研究以网络药理学为基础，运用动物试验验证传统中药方当归四逆汤对免疫的调节作用1材料与仪器11试验对象清洁级雄性 IC 健康小鼠(试验动物许可证号为 SCXK(JI)-2021-0003，长春亿斯实验动物技术有限公司)105 只，体质量(202)g12材料与仪器分析天平(Sartorius 公司，瑞士);低温高速离心机(Beckman Coulte 公司，美国);色谱仪 UHPLC(Thermo Scientific 公司，日本);质谱仪(ABSCIEXTM公司，日本);Milli-Q 纯水机(默克公司，德国);JA 精密电子天平(沈阳市科瑞永兴化玻仪器有限公司);全自动酶标仪(TECAN 公司，瑞士);4 冷藏冰箱(海尔集团股份有限公司)乙腈(ACN)、甲酸(FA)、甲醇，均为质谱级;匹多莫德口服液(江苏吴中医药集团有限公司苏州制药厂);D-半乳糖(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司);IL-6 试剂盒、TNF-试剂盒(上海酶联生物科技有限公司);SOD 试剂盒、MDA 试剂盒、8-OHdG 试剂盒(南京建成生物有限公司)2试验方法21当归四逆汤药液制备当归四逆汤原料(国药准字 H20030463，产品批号 20191003，河南省宛西制药股份有限公司):当归 12 g，桂枝 9 g，白芍 9 g，细辛 3 g，通草 6 g，炙甘草 6 g，大枣 8 枚，均经北华大学药学院生药学教研室王维副教授鉴定将当归等中药材加水没过药材浸泡 1 h，100 煎煮 1 h，滤出药渣继续加水煎煮，重复 3 次;合并 3次滤液，蒸干多余水分后冻干，4 保存备用22当归四逆汤成分分析将 21 制得的冻干粉末称取 05 g，加 2 mL 水溶解，于 4 下 1 200 r/min 离心 10 min;取上清进样 10 L，采用高效液相色谱-质谱联用仪分析得到DSD 正负离子流图，通过与数据库和文献进行比对，得到全部成分信息液相色谱条件:色谱柱 Waters BEHC 18Column(150 mm21 mm，17 m)，柱温35;流动相 A 为 01%甲酸-水;流动相 B 为乙腈;流速 03 mL/min每个组分分析时间为 15 min质谱条件:分别采用电喷雾电离(ESI)正离子和负离子模式进行检测，二级质谱采用 informationdependent acquisition(IDA)获得，并采用 high sensi-tivity 模式23当归四逆汤靶点预测将 22 所得成分以 score85 为条件进行进一步筛选将得到的成分运用“SMILES”在 PubChem(https:pubchemncbinlmnihgov/)数据库中查找其 2D 结构，利用其 2D 结构在 Swiss TargetPrediction(http:wwwswiss target predictionch/)数据库中预测靶点24免疫相关靶点预测利用