基于金属有机框架的荧光适配...检测红酒中黄曲霉毒素B_1_姚惠文.pdf

现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.6 306 基于金属有机框架的荧光适配体传感器检测红酒中黄曲霉毒素 B1 姚惠文*，王馨悦，雷欣莹（湖北中医药大学药学院，湖北武汉 430065）摘要：该文利用金属有机框架（Metal-organic Framework，MOF）材料和荧光标记的核酸适配体构建一种基于光诱导电子转移的荧光适配体传感器用于黄曲霉毒素 B1（Aflatoxin B1，AFB1）的检测。MOF 材料为氨基功能化的奥斯陆大学 66（Amino-functionalized University of Oslo 66，UiO-66-NH2），标记有四甲基罗丹明（Tetramethylrhodamine，TAMRA）荧光团的核酸适配体（TAMRA-aptamer）通过-堆积作用吸附于 UiO-66-NH2表面，由于光诱导电子转移使 TAMRA-aptamer 的荧光猝灭。加入目标物 AFB1后，核酸适配体与 AFB1特异性识别并结合，使核酸适配体从单链结构转变为稳定的内环结构。由于内环结构与 UiO-66-NH2之间的结合能力较弱，光诱导电子转移被阻断，TAMRA-aptamer 荧光恢复。该荧光适配体传感器用于 AFB1检测，在1.00100.00 ng/mL 范围内荧光信号强度与 AFB1浓度具有良好的线性相关性，相关系数的平方（R2）为0.994，检测限为0.50 ng/mL。该方法用于红酒中AFB1的测定，样品添加回收率为 90.00%101.00%。该方法操作简便、成本低、选择性好、灵敏度高，可用于红酒中 AFB1的快速检测。关键词：黄曲霉毒素 B1；金属有机框架；核酸适配体；荧光传感器 文章编号：1673-9078(2023)06-306-312 DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2023.6.0743 A Metal-organic Framework-based Fluorescent Aptasensor for Determination of Aflatoxin B1 in Red Wine YAO Huiwen*,WANG Xinyue,LEI Xinying(College of Pharmacy,Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan 430065,China)Abstract:A fluorescent aptasensor was constructed based on photoinduced electron transfer using an amino-functionalized metal-organic framework(MOF)from the University of Oslo 66(UiO-66-NH2)and fluorescently labeled aptamers for the determination of aflatoxin B1(AFB1).Tetramethylrhodamine-labeled(TAMRA-labeled)aptamers(TAMRA-aptamer)were absorbed onto the surface of the UiO-66-NH2 via-stacking and the fluorescence of the TAMRA-aptamer was quenched due to the photoinduced electron transfer.The conformation of TAMRA-aptamers,which specifically recognize and bind to AFB1,changed from a single chain to a stable internal loop,and the hindrance of photoinduced electron transfer due to the weak binding ability between the internal loop structure and UiO-66-NH2 led again to fluorescence of the TAMRA-aptamers.The fluorescent aptasensor is thus considered suitable for AFB1 detection to as low as 0.50 ng/mL.The intensity was proportional to AFB1 concentration in the range between 1.00 and 100.00 ng/mL,and the square of the correlation coefficient(R2)was 0.994.The recovery for the detection of AFB1 in red wine was 90.00101.00%.The developed method is simple,inexpensive,reasonably selective,and highly sensitive and can be used for the rapid determination of AFB1 in red wine.Key words:aflatoxin B1;metal-organic framework;aptamer;fluorescent sensor 引文格式：姚惠文,王馨悦,雷欣莹.基于金属有机框架的荧光适配体传感器检测红酒中黄曲霉毒素 B1 J.现代食品科技,2023,39(6):306-312.YAO Huiwen,WANG Xinyue,LEI Xinying.A metal-organic framework-based fluorescent aptasensor for determination of aflatoxin B1 in red wine J.Modern Food Science and Technology,2023,39(6):306-312.黄曲霉毒素 B1（Aflatoxin B1，AFB1）是由黄曲 收稿日期：2022-06-12 基金项目：湖北省教育厅科学技术研究项目（Q20212003）作者简介：姚惠文（1988-），女，博士，讲师，研究方向：食品质量安全检测技术，E-mail： 霉和寄生曲霉在高温、潮湿和有氧条件下产生的一种有毒次级代谢产物，能破坏人及动物的肝脏组织，诱发肝癌，甚至致死。1993 年 AFB1被世界卫生组织的癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）划定为 I 类致癌物1。奶制品、谷物现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.6 307 豆类、葡萄酒等在生产和储运等各个环节都可能受到AFB1污染，给食品安全带来隐患，给人们身体健康造成威胁2。目前，AFB1的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）3,4、高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）5和表面增强拉曼光谱法6等。虽然上述方法能准确可靠地检测 AFB1，但存在前处理过程复杂、耗时长、仪器昂贵等缺点。酶联免疫吸附法（ELISA）、荧光免疫层析法等免疫分析法也可用于AFB1的测定7,8，但所需抗体的制备周期长、成本较高、稳定性较差。因此，亟需开发简单、快速、灵敏度高且成本低的 AFB1检测方法。核酸适配体（Aptamer）是一小段经体外筛选得到的单链寡核苷酸序列（单链 DNA 或 RNA），与目标物的结合具有高亲和力和强特异性的特点9。与抗体相比，具有化学合成或修饰简单、稳定性高、识别目标物范围广等优点10。Aptamer 已作为一种分子识别元件与荧光、电化学和比色法等检测技术相结合用于生物传感分析11-13。其中，荧光适配体传感器具有灵敏度高、操作简便和原位实时等优点，广泛用于真菌毒素、蛋白质等的分析检测14,15。通过在适配体上同时修饰猝灭基团和荧光基团，利用适配体与目标物结合前后对荧光基团和猝灭基团距离的影响导致荧光强度的改变从而实现目标物的检测，荧光基团和猝灭基团配对的选择是构建这一类型荧光适配体传感器的难点所在。为了克服这一难点，氧化石墨烯、金纳米粒子和腐殖酸等纳米材料被用于荧光适配体传感器的构建，利用纳米材料对荧光团高效的荧光猝灭作用，提高传感器的分析检测性能16-18。但是，上述纳米材料或多或少具有价格昂贵、制备过程复杂、耗时等缺点。金属有机框架（Metal-organic Framework，MOF）材料作为一种新型多孔物质，是一种由金属离子和有机配体通过分子自组装而形成的具有周期性网络构造的晶体材料19,20。由于其孔径可调、比表面积大、良好的化学稳定性，已广泛用于生物传感器的构建21,22。UiO-66-NH2是一类锆金属 MOF，以富电子的 2-氨基对苯二甲酸为配体，可通过-堆积作用吸附并猝灭荧光标记的单链 DNA23。此外，UiO-66-NH2合成条件温和、制备周期短、操作简便、成本低，且稳定性好，在荧光生物传感器的构建中具有良好的应用前景。基于此，本研究构建了基于 UiO-66-NH2和四甲基罗丹明（Tetramethylrhodamine，TAMRA）标记的 aptamer（TAMRA-aptamer）的荧光适配体传感器用于 AFB1的快速检测，该荧光适配体传感器对 AFB1具有高度选择性，不受其它真菌毒素的干扰，成功用于红酒中AFB1的测定。1 材料与方法 1.1 主要仪器及试剂 Miniflex 600 X 射线衍射仪（X-ray Diffraction，XRD），日本理学株式会社；Zeiss Merlin Compact 场发射扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，SEM），德国蔡司公司；IS10 傅里叶变换红外光谱仪（Fourier Transform Infrared Spectrometer，FT-IR），美国热电公司（Thermo）；209F1 Libra 热重分析仪（Thermal Gravimetric Analyzer，TGA），德国耐驰公司（Netzsch）；RF-6000 荧光分光光度计，日本岛津公司。四氯化锆（ZrCl4）、2-氨基对苯二甲酸、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、无水乙醇、三(羟甲基)氨基甲烷（Tris）和盐酸（HCl），均购自国药集团化学试剂有限公司；黄曲霉毒素 B1（AFB1）、黄曲霉毒素 M1（AFM1）、赭曲霉毒素 A（OTA）和玉米赤霉烯酮（ZEN）标准品，均购自 Sigma-Aldrich 公司（中国上海）；TAMRA-aptamer（5-TAMRA-AGT TGG GCA CGT GTT GTC TCT CTG TGT CTC GTG CCC TTC GCT AGG CCC ACA-3）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并纯化。实验所用化学试剂均为分析纯，实验用水为 Millipore-Q 系统纯化的二次水，电阻率为 18.25 Mcm。1.2 MOF 的制备 参照文献24,25的方法制备 UiO-66-NH2，具体步骤如下：称取0.36 g 2-氨基对苯二甲酸和 0.46 g ZrCl4溶于 25 mL DMF 中，加入 2 mL 乙酸，超声待固体完全溶解后，转移至高压反应釜（内衬为聚四氟乙烯）中，于 120 烘箱中反应 24 h。自然冷却至室温后，离心，分别用 DMF 和无水乙醇各洗 3 次（浅黄色果冻状），真空干燥箱内70 干燥过夜，得到浅黄色UiO-66-NH2固体。1.3