超高效液相色谱法检测特殊医...配方食品中22种游离氨基酸_尹丽丽.pdf

尹丽丽，郑红，程志，等.超高效液相色谱法检测特殊医学用途配方食品中 22 种游离氨基酸 J.食品工业科技，2023，44（14）：264271.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022080065YIN Lili,ZHENG Hong,CHENG Zhi,et al.Determination of 22 Free Amino Acids in Food for Special Medical Purposes by Ultra-performance Liquid ChromatographyJ.Science and Technology of Food Industry,2023,44(14):264271.(in Chinese with Englishabstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022080065 分析检测 超高效液相色谱法检测特殊医学用途配方食品中超高效液相色谱法检测特殊医学用途配方食品中 22 种游离氨基酸种游离氨基酸尹丽丽，郑红，程志，卢兰香，薛霞，王骏，胡梅，刘艳明*（山东省食品药品检验研究院，山东省特殊医学用途配方食品质量控制工程技术研究中心，山东省食品药品安全检测工程技术研究中心，山东济南 250101）摘要：本文建立了特殊医学用途配方食品中 22 种游离氨基酸的超高效液相色谱检测方法。样品中氨基酸用磺基水杨酸提取，以 2,4 二硝基氟苯（DNFB）为柱前衍生试剂，以乙腈水-甲酸铵为流动相梯度洗脱，HSS T3 色谱柱高效分离，超高效液相-二极管阵列检测器检测，外标法定量。结果显示，22 种氨基酸在 2100 g/mL 范围内线性关系良好（R20.99）。方法检出限（S/N3）为 10 mg/100 g，定量限（S/N10）为 25 mg/100 g，低、中、高三个加标水平的回收率在 90.1%109.1%，相对标准偏差为 0.8%6.9%。方法简单高效、准确度高、重复性好，适用于特殊医学用途配方食品中 22 种游离氨基酸的定性、定量分析，为保障特殊医学用途配方食品的质量安全提供技术支持。关键词：特殊医学用途配方食品，游离氨基酸，柱前衍生，2,4 二硝基氟苯，超高效液相色谱法本文网刊:中图分类号：S513 文献标识码：A 文章编号：10020306（2023）14026408DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022080065Determinationof22FreeAminoAcidsinFoodforSpecialMedicalPurposesbyUltra-performanceLiquidChromatographyYINLili，ZHENGHong，CHENGZhi，LULanxiang，XUEXia，WANGJun，HUMei，LIUYanming*（Shandong Institute for Food and Drug Control,Shandong Research Center of Engineering and Technology for QualityControl of Food for Special Medical Purposes,Shandong Research Center of Engineering and Technology for SafetyInspection of Food and Drug,Jinan 250101,China）Abstract：A method was established to determine 22 free amino acids in food for special medical purposes by ultra-performance liquid chromatography.After extraction with sulfosalicylic acid and derivation with 2,4-dinitrofluorobenzene(DNFB),the samples were eluted with acetonitrile water-ammonium formate as mobile phase.Amino acids were separatedby HSS T3 column and detected with diode-array detector by external standard method.Results showed that,the 22 aminoacids were linear in the range of 2100 g/mL with correlation coefficients higher than 0.99.The limits of detection(S/N3)were 10 mg/100 g,and the limits of quantification(S/N10)were 25 mg/100 g.The recoveries were in the range of90.1%and 109.1%with relative standard deviation(RSD)from 0.8%to 6.9%.This method was simple,efficient,accurateand reproducible.It was suitable for determination of 22 free amino acids in food for special medical purposes,which couldprovide technical support to ensure the quality and safety.Keywords：food for special medical purposes；free amino acid；pre-column derivatization；2,4-dinitrofluorobenzene；ultra-performance liquid chromatography 收稿日期：20220808 基金项目：2019 年度山东省重点研发计划（医用食品）（2019YYSP020）。作者简介：尹丽丽（1987），女，本科，高级工程师，研究方向：食品安全分析与风险预警，E-mail：yinli_。*通信作者：刘艳明（1981），女，博士，研究员，研究方向：食品安全分析与风险预警，E-mail：。第 44 卷 第 14 期食品工业科技Vol.44 No.142023 年 7 月Science and Technology of Food IndustryJul.2023 特殊医学用途配方食品是为满足进食受限、消化吸收障碍、代谢紊乱或特定疾病状态人群对营养素或膳食的特殊需求，而专门加工配制而成的配方食品，如氨基酸代谢障碍配方食品。氨基酸作为合成蛋白质的重要原料，因其分子量小、易吸收常成为特殊医学用途配方食品首选的营养添加剂，但若摄入不当，会影响人体的正常生命代谢1。2019 年相关部门积极整顿了特殊医学用途配方食品行业乱象，被行业称为特殊医学用途配方食品发展元年，截至2020 年，特殊医学用途配方食品已注册超过 45 款，建立和规范特殊医学用途配方食品中相关检验标准及方法意义重大。GB 29922-20132规定了 22 种可用于特殊医学用途配方食品中的氨基酸种类及含量，但 GB 5009.124-20163中分析的目标物仅限 16 种，未能覆盖胱氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、色氨酸和谷氨酰胺；卫生部公布的食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第二批）中规定的 L-羟脯氨酸属于非法添加氨基酸，但目前的检验标准SN/T 3929-20144不包括特殊医学用途配方食品基质。国外报道的氨基酸检测对象大多为生物样品或普通食品，与种类繁多、基质复杂的特殊医学用途配方食品差别大，使得常规检测手段难以直接应用。国内针对特殊医学用途配方食品的已报导文献目前仅有 6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（AQC）衍生法5，该方法限于 GB 25596-20106中的 19 种氨基酸，且方法对流动相 pH 要求极其严苛，适应性差。调研文献发现，现有检测氨基酸的方法有茚三酮柱后衍生-氨基酸分析仪检测7、衍生化反应-液相色谱仪检测811、液相色谱-串联质谱法1215等，氨基酸分析仪检测目标物局限性强，仪器专用，实验室普及率低；液相色谱-质谱仪器本身价格昂贵，常采用的消除基质效应方式-同位素内标法12也进一步提高了检测成本。本文拟采用液相色谱法检测 22 种游离氨基酸。基于氨基酸本身没有紫外吸收，需经过衍生化反应引入生色基团后进行检测。据报道，用于柱前衍生的试剂有 6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（AQC）16、邻苯二甲醛（OPA）17、异硫氰苯酯（PITC）1820、9-芴甲氧羰酰氯（FMOC-Cl）2122、丹磺酰氯（Dansyl-Cl）23、2,4 二硝基氟苯（DNFB）2426等。其中，AQC 与氨基酸反应快，副产物少，但是衍生试剂价格昂贵；OPA 主要与一级氨基酸反应，不能与二级氨基酸直接反应；PITC 衍生过程需去除多余的衍生试剂，且痕量的 PITC 会缩短分析柱的寿命；FMOC-Cl 形成的衍生产物需萃取，且与组氨酸形成衍生物不稳定，影响定量；Dansyl-Cl 易生成多级衍生产物；DNFB 衍生技术虽然已有文献或资料报道，但与普通液相色谱联合检测也存在缺陷，如衍生反应时间长；使用 5 m 色谱柱2426柱效低，分析时间长；流动相采用 N,N 二甲基甲酰胺24、三乙胺25或者磷酸盐26，对环境、色谱柱、仪器均不友好等。本研究针对 GB 29922-2013 规定的所有氨基酸（色氨酸除外，因其具发色基团，可用紫外检测器直接测定）和非法添加的 L-羟脯氨酸，建立了 DNFB 衍生特殊医学用途配方食品中 22 种游离氨基酸的超高效液相色谱法，方法简单高效、试剂绿色环保，填补了 GB 29922-2013 中检测方法缺失的空白，检测范围扩增了 L-羟脯氨酸。方法为特殊医学用途配方食品企业质量控制提供技术支持，为行业发展提供技术保障。1材料与方法 1.1材料与仪器天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、丝氨酸（Ser）、谷氨酰胺（Gln）、精氨酸（Arg）、苏氨酸（Thr）、脯氨酸（Pro）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、异亮氨酸（lle）、亮氨酸（Leu）、组氨酸（His）、苯丙氨酸（Phe）、赖氨酸（Lys）、酪氨酸（Tyr）标准品纯度均99%，Dr.EhrenstorferGmbH 公司；L-羟脯氨酸（L-Hyp）、瓜氨酸（Cit）、丙氨酸（Ala）、胱氨酸（Cys）标准品纯度均99%，Bepure 公司；甘氨酸（Gly）纯度99%，中国计量科学研究院；天冬酰胺（Asn）、鸟氨酸（Orn）标准品纯度99%，上海安谱实验科技股份有限公司；牛磺酸（Tau）标准品纯度99.8%，Sigma-Aldr-ich 公司；ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（2.1 mm100 mm，1.8 m）、ACQUITY UPLC BEH ShieldRP18 色谱柱（2.1 mm100 mm，1.7 m）、ACCQ-TAG ULTRA C18色谱柱（2.1 mm100 mm，1.7 m）美国 Waters 公司；甲醇、乙腈均为色谱纯，美国Fisher 公司；盐酸、乙酸、氢氧化钠、甲酸铵、磺基水杨酸、亚铁氰化钾、乙酸锌、碳酸钠、磷酸二氢钾、碳酸氢钠均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；2,4 二硝基氟苯（DNFB）阿法埃莎-中国化学有限公司；实验用特殊医学用途配方食品：氨基酸配方、乳蛋白深度水解配方、乳蛋白部分水解配方、氨基酸代谢障碍配方均为市售；PT