菊芋NAC转录因子家族基因的鉴定及分析_郭怡婷.pdf

研究报告生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(6):217-232收稿日期：2022-09-09 基金项目：青海省科技厅应用基础研究项目（2022-ZJ-736），青海大学青年科研基金项目（2021-QNY-2）作者简介：郭怡婷，女，硕士研究生，研究方向：蔬菜遗传育种与分子生物学；E-mail:通讯作者：赵孟良，男，博士，副研究员，研究方向：蔬菜遗传育种与分子生物学；E-mail:菊芋 NAC 转录因子家族基因的鉴定及分析郭怡婷1，2 赵文菊1，2 任延靖1，2，3 赵孟良1，2，3（1.青海大学，西宁 810016；2.青海省农林科学院 青海省蔬菜遗传与生理重点实验室，西宁 810016；3.青海大学三江源生态和高原农牧业国家重点实验室，西宁 810016）摘 要：通过转录组学的方法，筛选与菊芋叶片响应干旱胁迫密切相关的 NAC 转录因子，为今后菊芋 NAC 基因的克隆及功能验证奠定理论基础。以抗旱青芋 2 号菊芋品种为实验材料，采取 25%PEG6000 渗透模拟干旱胁迫的方法，分别在处理 0、18、24 和 36 h 后取菊芋叶片，通过转录组测序的方法，筛选干旱胁迫下菊芋叶片中差异表达的 NAC 转录因子，并对其进行分析。在菊芋叶片中共鉴定出了 70 个 NAC 基因，序列长度在 408-1 869 bp 之间，检测到的 motif 基序的长度在 21-50 个碱基不等，系统进化树分析显示，大部分的 HtNAC 基因能够与其他的 NAC 基因聚为一类；通过与已报道的抗旱相关的其他作物中的 NAC 基因进行聚类发现，HtNAC90-3 与 AtNAC72 聚为一类，HtNAC67-3 与 AtNAC055 聚为一类，HtNAC2-1 与 AtNAC019 聚为一类，HtNAC36 与SINAC6 聚为一类，HtNAC83-1 与 AtNAC96 聚为一类；组织特异性表达分析结果显示，HtNACs 基因在种子和花瓣中的表达量相对较 高，干旱诱导表达分析显示，分别有 38 个和 11 个 HtNACs 基因在菊芋叶片和根中呈现出诱导后上升表达的趋势。本研究发现HtNACs 在种子和花瓣中表达量较高，尤其以花瓣中的表达量最高，后续可从菊芋的花瓣中克隆获得菊芋 HtNACs 并进行相关功能验证等工作。关键词：菊芋；NAC；转录因子；鉴定分析DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2022-1111Identification and Analysis of NAC Transcription Factor Family Genes in Helianthus tuberosus L.GUO Yi-ting1,2 ZHAO Wen-ju1,2 REN Yan-jing1,2,3 ZHAO Meng-liang1,2,3（1.Qinghai University,Xining 810016;2.Academy of Agriculture and Forest Science,Qinghai Key Laboratory of Vegetable Genetics and Physiology,Qinghai Province,Xining 810016;3.State Key Laboratory of Plateau Ecology and Agriculture,Qinghai University,Xining 810016）Abstract:The NAC transcription factors closely related to drought stress responses of Jerusalem artichoke（JA）（Helianthus tuberosus L.）leaves were screened by transcriptome method,which may lay a theoretical foundation for the cloning and functional verification of JA NAC gene in the future.In this study,the drought-resistant Qingyu No.2 JA was used as experimental material.The leaves of JA were collected after treatment for 0,18,24 and 36 h,respectively,and the differentially expressed NAC transcription factors were screened and analyzed by transcriptomic sequencing.Referenced as RNA-Sequencing data,70 NAC genes were identified in JA leaves with sequence length between 408-1 869 bp.The lengths of the detected motif ranged from 21 to 50 bases.Phylogenetic tree analysis showed that most HtNACs genes were clustered with other NAC genes.It was found that HtNAC90-3 was clustered with AtNAC72,HtNAC67-3 was clustered with AtNAC055,HtNAC2-1 was clustered with AtNAC019,HtNAC36 was clustered with SINAC6 through the clustering of NAC genes in other crops related to reported drought resistance.HtNAC83-1 was clustered with AtNAC96.Tissue-specific expression analysis showed relatively high HtNAC expression in seeds and petals.Drought-induced expression analysis showed that 38 and 11 HtNAC genes revealed the increasing expression trend after drought induction in JA leaves and roots,respectively.In this study,it was found that the expressions of HtNACs in seeds and petals was high,especially in petals.Subsequently,HtNACs of JA can be cloned from petals of JA and related functions can be verified.Keywords:Helianthus tuberosus L.;NAC;transcription factor;identification and analysis生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.6218菊芋（Helianthus tuberosus L.）属菊科多年生向日葵属草本植物，是高度杂合的异源六倍体作物（2n=6X=102），截至目前该作物尚未进行基因组测序。菊芋原产于北美，主要加工利用部位是地下部块茎，块茎富含菊粉，是一种重要的乙醇生产和医疗用途工业作物1。菊粉可调节人体肠道菌群，双向调节血糖血脂，被用于功能食品的添加剂，菊芋的茎和块茎部位分别是块茎膨大前和成熟时的主要菊粉贮藏器官2。菊芋具有生态适应性强、繁殖速度快、地上部生物量大、管理成本低、能量转换效率高等生物特性，适合在不降低粮食安全的情况下在边际土地上种植3，目前已成为我国沿海边缘土地利用的一种很有前途的作物4-5。由于菊芋独特的营养品质和功能价值，许多国家已将菊芋作为蔬菜、饲料作物和用于粮食和工业用途的生物能源材料种植6-10。NAC 转录因子是较大的一类转录因子家族，也是植物界特有的一类转录因子，据预测在拟南芥、水稻、葡萄、杨树和烟草中分别存在 117、151、79、163 和 152 个 NACs 基 因11-12，大 量 研究还表明，NAC 转录因子在植物发育、衰老、果实成熟过程以及生物和非生物胁迫响应中发挥着重要 作用13-18。作为一种重要的调控蛋白，许多 NAC 转录因子已被证明参与了植物应对干旱胁迫的调控过程。利用胁迫诱导启动子，过表达 OSNAC6 的转基因植株表现出显著的高抗旱性，这是由于 OSNAC6 转录激活了一个过氧化物酶基因19，此外，OSNAC10、OSNAC5 和 OSNAC9 均在干旱胁迫响应中发挥重要作用，其过表达也显著提高了作物的抗旱性20-22。近年来研究发现，NAC 转录因子控制着植物的茎尖分生组织的形成23、花发育24、叶片衰老25和细胞分裂26等过程，与天然产物的生成合成也有一定的联系，同时 NACs 在植物响应干旱胁迫时发挥着积极重要作用27，未来可通过基因工程手段进行植物新品种的选育和改良。目前大量的 NACs 转录因子已在拟南芥、玉米、水稻、棉花和白菜等作物中被发现并研究28-30，但未见 NAC 转录因子在菊芋中的系统研究。本文以青海大学农林科学院菊芋研发中心自主选育的青芋 2号菊芋品种为试验对象，采用 PEG6000 模拟干旱胁迫，对干旱胁迫下处理不同时间的菊芋叶片进行转录组测序，筛选分析与菊芋抗逆密切相关的 NAC 转录因子，对其进行初步鉴定及在干旱胁迫下的表达模式进行分析，为进一步探究菊芋 NAC 转录因子的功能奠定基础。1 材料与方法1.1 材料选取青芋 2 号菊芋品种为研究材料，于 2020 年4 月种植于青海大学农林科学院园艺研究所试验基地，正常田间肥水管理，于 9 月下旬在开花期进行取样，选取盛花时期的 7 个组织，包括根、块茎、花茎、叶、花瓣、管状花和幼嫩种子；液氮速冻置于-80冰箱贮藏备用，每个样品选取 3 个生物学重复。同时选取采用25%的PEG6000模拟干旱胁迫0、18、24 和 36 h 的菊芋叶片与幼根，分别采样，液氮速冻置于-80冰箱贮藏备用，每个样品选取 3 个生物学重复。1.2 方法1.2.1 RNA 的提取及第一链 cDNA 的合成 采用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit 提 取 总RNA，方法参考试剂盒说明书，用 0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 纯度及完整性，微量紫外分光光度计检测 RNA 浓度及质量，基因组 DNA 去除及 cDNA合 成 采 用 PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser，方法参考试剂盒说明书，最终将 cDNA 溶液稀释为 100 ng/L 保存于-20冰箱备用。1.2.2 HtNAC 基因的筛选 根据干旱胁迫下菊芋叶片的转录组信息（SUB8106956）、转录组组装结果以及转录组测序注释文件，以 NAC 为关键词依次在 NR、Tremble 和 Swissprot 注释文件中进行搜索，根据搜索到的测序序列 Cluster 编号查找序列信息，查找到的 Cluster 序列提交至 NCBI（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）中进行在线 BLAST 分析后，获得的比对序列提交至在线工具 https:/web.expa