发酵饲料对日本沼虾生长性能...氧化能力及肠道微生物的影响_李正中.pdf

doi:10.7541/2023.2022.0496发酵饲料对日本沼虾生长性能、抗氧化能力及肠道微生物的影响李正中1 刘 波1,2,3 刘志桦3 孙存鑫2 周群兰2 郑肖川2 孙 梅4 高 亮4(1.上海海洋大学水产与生命学院,上海 201306;2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心,农业农村部淡水渔业和种质资源利用重点实验室,无锡 214081;3.南京农业大学无锡渔业学院,无锡 214128;4.江苏省苏微微生物研究有限公司,无锡 214063)摘要:为探究发酵饲料在日本沼虾中的养殖效果,设计5个试验组,分别投喂L1(100%基础饲料组)、L2(87.5%基础饲料+12.5%发酵饲料)、L3(75%基础饲料+25%发酵饲料)、L4(50%基础饲料+50%发酵饲料)和L5(100%发酵饲料)。试验选取大小相近的日本沼虾(0.090.01)g进行为期56d的养殖试验,评估日本沼虾生长性能,抗氧化指标和肠道微生物组成。结果显示,饲料经过发酵后可溶蛋白和小肽含量得到显著提高(P0.05),饲料有益菌含量增加,霉菌得到抑制。养殖试验表明各组存活率均在80%以上,增重率呈先上升后下降趋势,L3和L4组增重率显著高于对照组(P0.05),饵料系数显著低于对照组(P0.05)。L3、L4和L5组超氧化物歧化酶(SOD)活性显著高于L1组(P0.05),L2、L3和L4组丙二醛(MDA)含量显著低于L1组(P0.05),L2和L5超氧阴离子清除率显著高于L1组(P0.05)。各试验组血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)含量均显著低于对照组(P0.05)。肠道微生物测序结果显示,L3组-多样性指数高于L1组,在属水平上,L1组的气单胞菌属丰度显著高于L3组(P0.05),而L1组分歧杆菌属和芽孢杆菌属丰度显著低于组L3组(P0.05)。结果表明,发酵饲料能够增加饲料中营养物质含量,提高日本沼虾增重率,降低饵料系数,增强抗氧化能力,可以改善日本沼虾肠道微生物群落结构,对致病菌属有抑制作用,适宜的发酵饲料添加比例为25%。关键词:发酵饲料;生长性能;抗氧化能力;肠道微生物;日本沼虾中图分类号:S965 文献标识码:A 文章编号:1000-3207(2023)09-1435-11 自2020年起,农业农村部规定饲料中全面禁止添加抗生素,以此来减少滥用抗生素带来的危害1。为此学者们研究出了很多替代方案,包括:抗菌肽2、中草药提取物3、益生菌4和后生元5等,其中,益生菌因其安全性、低成本和应用方便等优点而受到广泛青睐。水产养殖中的益生菌是一类对养殖生物和养殖水体有益的微生物的总称,包括:光合细菌(Photosynthetic bacteria)6、乳酸菌(Lacto-bacillus)7、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)8和芽孢杆菌(Bacillus)9等,目前在养殖业中,常用的菌种共有35种10。微生物固态发酵饲料是指在人工控制下利用微生物对饲料底物进行发酵的过程,具有改变饲料的营养特性、适口性和安全性的优点11。微生物在发酵过程中可对饲料进行“预消化”,通过自身代谢活动可以减少饲料中单宁12、植酸13、游离棉酚14和硫甙15等抗营养因子的含量,增加可溶性蛋白16、酸溶性蛋白17和小肽18等营养物质的含量。另外,研究表明微生物在发酵过程中可以分解膳食纤维,产生多种单糖,有利于肠道微生物的生长19,20,并且微生物能在宿主体内定植,抑制有害菌对消化肠黏膜的损害21。此外,微生物还可代谢产生短链脂肪酸提高养殖动物免疫力22,23。因此,微生物发酵饲料的应用能为水产养殖业高质量发第 47 卷 第 9 期水 生 生 物 学 报Vol.47,No.9 2023 年 9 月ACTA HYDROBIOLOGICA SINICAS e p.,2 0 2 3 收稿日期:2022-12-12;修订日期:2023-01-11基金项目:中国水产科学研究院基本科研业务费(2022XT0401和2020TD59);国家现代农业产业技术体系(CARS-48);江苏现代农业产业技术体系建设专项资金(JATS2022514);无锡市现代农业前瞻性及共性关键技术类项目(N20203007)资助 Supportedby Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund,CAFS(2022XT0401 and 2020TD59);China AgricultureResearch System of MOF and MARA(CARS-48);Jiangsu Modern Agricultural Industry Technology System(JATS 2022 514);Wuxi Modern Agriculture Forward-looking and Common Key Technology Projects(N20203007)作者简介:李正中(1999),男,硕士研究生;研究方向为水产动物营养与饲料。E-mail:通信作者:刘波,E-mail:展提供坚实的保障。日本沼虾(Macrobrachium nipponense)俗称青虾,隶属长臂虾科(Palaemonidae),是我国淡水养殖业中主要的经济虾类之一,养殖产量与效益比较稳定。据统计,2021年日本沼虾的产量约为23万吨 24。目前养殖户主要使用的是南美白对虾(Penaeus van-namei)或罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)等其他相关品种的饲料,导致适口性不强,吸收利用效率低下,导致残饵堆积和疾病等问题25。而发酵饲料则可以在喂食前对饲料进行“预消化”,投喂后养殖动物可以更易吸收营养物质,减少水体污染。因此本试验用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)混合菌种发酵基础日本沼虾饲料,通过对比饲料发酵前后营养物质的变化,探索发酵饲料和基础饲料的不同配比对日本沼虾生长性能,抗氧化能力及肠道微生物的影响,以期选出发酵饲料和基础饲料适宜的配比。1 1 材料与方法 1.11.1 试验饲料日本沼虾基础饲料由江苏冠乾特种水产饲料有限公司生产(配方见表 1),复合菌组包括:枯草芽孢杆菌CGMCC No.18684、酿酒酵母CICC1421和植物乳杆菌CCTCC No:M20211221,浓度见表 2。发酵饲料由复合菌种发酵基础饲料制得,复合菌种由本实验室保存提供,将复合菌剂与日本沼虾饲料混合均匀,添加量为饲料重量的0.5%(w/w),加灭菌水调节物料含水量为30%(w/w),在发酵袋(有单向出气阀门)密闭发酵,环境温度恒定35,饲料发酵5d。将基础饲料与发酵饲料按照不同比例混合均匀,设计5个试验组:L1组(100%基础饲料)、L2组(87.5%基础饲料+12.5%发酵饲料)、L3组(75%基础饲料+25%发酵饲料)、L4组(50%基础饲料+50%发酵饲料)和L5组(100%发酵饲料)。1.21.2 养殖管理养殖试验在中国水产科学研究院淡水渔业研究中心大浦基地开展。试验选取规格相近的日本沼虾(0.090.01)g共900尾,随机分成5组,每组3个生物学重复,每个重复60尾,养殖于15个直径 140 cm,深 100 cm 的圆柱体养殖缸中，其中养殖水深50 cm。每日根据饲料分组情况投喂相应的饲料,日投喂量为日本沼虾体重的5%8%(根据日本沼虾的摄食情况和生长情况调整投喂量,以投喂 1h 后吃完为宜),每日投喂 3 次(8:00、12:00 和 18:00),均为饱食投喂,投喂完1h后将未吃完的饲料捞出烘干称重。定期检测水质指标,保证试验期间溶氧6.0 mg/L,pH 7.30.6,氨氮0.2 mg/L,亚硝酸盐0.005 mg/L。每天使用排污管排污,每周1次换水。每天观察日本沼虾的生长和摄食情况,发现死虾后及时捞起,称重并做好记录,养殖试验共进行56d。1.31.3 饲料活菌数量检测活菌检测项目:细菌总数、芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌和霉菌。总菌-采用倾注法,在LB营养琼脂平板上,35培养48h后计数;芽孢杆菌-采用倾注法,将菌悬液经80水浴10min后在LB营养琼表 1 基础饲料配方Tab.1 Basic feed formula成分Composition比例Ratio(%)营养物质含量Content ofnutrients比例Ratio(%)国产鱼粉Domesticfishmeal4.0干物质Dry matter89.62虾粉Shrimp powder2.0粗蛋白Crudeprotein38.12虾壳粉Shrimp shellpowder3.0粗脂肪Crude fat5.12鸡肉粉Poultry by-product meal2.0赖氨酸Lysine1.60鸡血球蛋白粉Chicken hemoglobinpowder6.0蛋氨酸Methionine0.46谷氨酸渣Glutamicacid residue2.0色氨酸Tryptophan0.296鱿鱼膏Squid paste2.0豆粕46Soybean meal10.0花生粕Peanut meal8.0菜籽饼Rapeseedmeal14.0棉籽浓缩蛋白Cottonseed proteinconcentrate5.0棉粕Cottonseed meal7.0米糠Rice bran10.5小麦粉(面粉)Flour17.97大豆油Soybean oil0.5大豆磷脂油Soybeanlecithin oil1.0沸石粉Zeolitepowder2.0磷酸二氢钙Ca(H2PO4)22.0大黄提取物Rhubarbextract0.03预混料Premix1.0表 2 复合菌剂组成和初始浓度Tab.2 Composition and concentration of compound bacterialagent菌种Strain菌浓Concentration(CFU/kg)枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis5.0E+12酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae1.5E+12植物乳杆菌Lactobacillus plantarum1.0E+121436水 生 生 物 学 报47 卷脂平板上,35培养48h后计数;乳酸菌-采用倾注法,在MRS固体培养基中,35厌氧培养48h后计数,在平板上能产生透明圈的视为产酸乳杆菌,反之则为不产酸乳杆菌;酵母菌-采用倾注法,在虎红(孟加拉红)培养基中,2830培养48h后计数;霉菌参照国标GB/T13092-2006,采用倾注法,在高盐察氏培养基中,29培养96h后计数。1.41.4 可溶蛋白和小肽含量检测采用考马斯亮蓝法测定饲料可溶蛋白含量:在一定蛋白浓度内,蛋白质和染料结合符合比尔定律,此染料和蛋白质结合后颜色由红转蓝,最大吸光由465转为595 nm,通过测定595 nm处的吸收量测定蛋白含量26。采用三氯乙酸法测定饲料中的小肽含量:利用三氯乙酸作蛋白质沉淀剂,将样品中的蛋白质和肽链较长的肽沉淀,将其中的小肽用酸溶解出来,从而测得小肽含量27。1.51.5 样品采集在养殖结束后,每个养殖桶随机挑取30尾虾,用1 mL 无菌注射器,在围心腔采血后,4000 r/min离心 10min 后放入2 mL离心管中,血样采用混合样本,每桶3个混合样本;在采集血淋巴后,虾用无菌PBS溶液冲洗、无菌滤纸吸干后,在冰上进行解剖,分离肝胰腺与肠道,放入80保存,一部分用于肠道菌群分析,剩余虾肠道用于酶活指标的测定,肠道和肝胰腺采取混合样本,每桶3个样;每个养殖桶随机挑取30尾虾,剥出肌肉,放入2 mL 冻存管中,在80条件下进行保存。1.61.6 生长指标测定在养殖试验结束后,记录日本沼虾的起始重量(IBW)和末重量(FBW)，并计算出存活率(SR)、增重率(WGR)和饵料系数(FCR)。增重率