基于超高效液相色谱-四极杆...藏药圆柏子化学成分分析研究_苟晓玲.pdf

成都中医药大学学报 年 月第 卷第 期，.，.基于超高效液相色谱四极杆静电场轨道阱高分辨质谱的藏药圆柏子化学成分分析研究苟晓玲，丁银，罗玉婷，易欢，谢雨宸，曾宇骄，范刚（成都中医药大学 药学院，四川 成都；成都中医药大学 民族医药学院，四川 成都）【摘 要】目的：建立藏药圆柏子化学成分的超高效液相色谱四级杆 静电场轨道阱高分辨质谱（）定性分析方法。方法：用 （.，.）色谱柱进行分离，以甲醇.甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，在正、负离子监测模式下采集数据。采用 .软件计算出化合物的精确相对分子质量、准分子离子峰、特征碎片离子等信息，并参考、和 质谱数据库及文献报道数据对圆柏子的化学成分进行识别和鉴定。结果：共鉴定出 种化学成分，种黄酮类、种苯丙素类、种生物碱类、种萜类、种有机酸类、种氨基酸类及 种其他类别成分。结论：本研究首次对圆柏子的化学成分进行定性鉴定，为其进一步的药效物质基础研究和质量控制提供了科学依据。【关键词】藏药；圆柏子；超高效液相色谱四极杆静电场轨道阱高分辨质谱；化学成分；质量控制【中图分类号】；.【文献标识码】【文章编号】（）【编码】.【引文格式】苟晓玲，丁银，罗玉婷，等.基于超高效液相色谱四极杆静电场轨道阱高分辨质谱的藏药圆柏子化学成分分析研究.成都中医药大学学报，（）：.【开放科学（资源服务）标识码（）】【基金项目】国家重点研发计划项目（）；四川省重点研发项目（）【第一作者】苟晓玲，女，年生；硕士研究生在读；：.【通信作者】范刚，男，年生；博士，教授；：.圆柏子（，藏文音译“巴珠木”）为柏科植物大果圆柏（）及其同属植物的干燥球果。中华本草藏药卷记载：“味苦，性凉，能收敛赤巴，愈疮，干黄水。”新修晶珠本草记载：“清肾热，利胆。”圆柏子是七味入达散、十三味刺痛散等藏药复方的主要组成药味。现代研究表明，圆柏子含有 蒎烯、蒎烯和榄香醇等挥发性成分。但是，圆柏子中的其它化学成分定性分析研究较少，影响其质量控制和有效成分研究。超高效液相色谱四极杆 静电场轨道阱高分辨质谱（）具有高灵敏度、高分辨率、高质量精度的特点，可以实现对多种成分同时快速的鉴定和指认，因此在鉴定植物药复杂化学成分方面具有独特的优势。目前，技术已经应用于大三果、唐古红景天、沙棘等藏药的化学成分分析。本研究采用 技术全面分析和鉴定圆柏子的化学成分，为其药效物质基础研究和质量控制提供科学依据。材料 超高效液相色谱仪、高分辨质谱仪、.工作站（美国 公司）；型电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；超声清洗器（上海必能信有限公司）；台式低速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）。色谱级乙腈（批号：）和甲醇（批号：）购于美国 公司；分析级甲酸（批号：）及甲醇（批号：）等分析纯试剂均购于成都市科隆化学品有限公司；水为屈臣氏蒸馏水。圆柏子药材购于青海省环翊阁商贸有限公司，经成都中医药大学范刚教授鉴定为柏科圆柏属植物大果圆柏（）的干燥球果。第 期苟晓玲 等 基于超高效液相色谱四极杆静电场轨道阱高分辨质谱的藏药圆柏子化学成分分析研究 方法.供试品溶液制备取圆柏子粉末约，精密称定，置 锥形瓶中，精密加入甲醇 ，密塞，称定重量，超声（，），放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心（，）取上清液过.微孔滤膜，即得。.色谱条件 （.，.）色谱柱；流动相：甲醇（）.甲酸溶液（）；梯度洗脱程序为 ，；，；，；，；，；，；流 速.；柱 温；进样量 。.质谱条件采用 离子源，正、负离子模式检测，正离子检测模式，喷雾电压 ；负离子检测模式，喷雾电压 ，鞘气流速.，辅助气流速.，毛细管温度 ；采用 扫 描 模 式，分 辨 率，分辨率 ，扫描范围 。.数据处理将原始数据导入 .软件中，对其进行谱峰提取、保留时间矫正、峰对齐及噪音信号去除等预处理。建立工作流程检索数据库，根据一级质谱提供的精确分子量，采用.软件拟合分子式，误差范围.（），并将样品质谱数据信息与数据库、和 中的化合物数据进行匹配，通过数据库中精准的相对分子质量以及二级质谱碎片离子对化合物进行归属和鉴定。同时查阅、等在线数据库以及相关文献报道检索化合物可能的化学结构式和裂解碎片，对鉴定的成分进行比对和检验，并总结裂解规律。结果根据“.”项下的方法制备供试品溶液，按上述色谱、质谱条件进行分析，分别得到正、负离子模式下总离子流图，见图。根据.软件计算出的高分辨精确质量数，据实际测得的相对分子质量与理论相对分子质量二者偏差范围为.的原则及同位素丰度比，确定各色谱峰对应化合物的分子式，通过二级质谱的碎片离子推测化合物的结构式，再根据相关文献进行鉴定。共鉴定出 种化学成分，种黄酮类、种苯丙素类、种生物碱类、种萜类、种有机酸类、种氨基酸类及 种其他类别成分。鉴定的化合物具体质谱裂解信息见表。注：正离子 负离子图 圆柏子正负离子模式下的总离子流图.黄酮类成分的鉴定本研究发现，圆柏子含有穗花杉双黄酮、柏木双黄酮、芹菜素、木犀草苷、木犀草素、原花青素、原花青素 等 种黄酮类化合物。黄酮类化合物的、位碳上常有羟基取代。查阅相关文献发现双黄酮类：穗花杉双黄酮、柏木双黄酮互为同分异构体，其极性大小：柏木双黄酮 穗花杉双黄酮，故在正离子模式下，柏木双黄酮保留时间为.，穗花杉双黄酮保留时间为.。以柏木双黄酮为例分析，可观察到一个 .的准分子离子峰，经 .软件拟合后推测其分子式为，产生的主要碎片离子为：.、.、.、.、.、.、.、.、.，通过数据库检索，并与文献比对，确定该成分为柏木双黄酮，其二级质谱图见图，可能的裂解途径见图。第一种裂解途径是 环的、键断裂，丢失 的碎片，得到 .的碎片离子。.的碎片离子的 环 号位与 环 号位的两个 发生麦氏重排，发生分子内脱水，失去一个，形成 .的碎片离子，同时丢失 碎片产生 .的碎片离子；第二种裂解途径可能是 环的、键断裂，丢失的碎片，得到 .的碎片离子，其 环 号位与 环 号位的两个 亦可发生麦氏重排，形成 .的碎片离子。成都中医药大学学报 年第 卷图 柏木双黄酮的二级质谱图图 柏木双黄酮的质谱裂解途径.萜类成分的鉴定萜类化合物具有两个或两个以上异戊二烯单位，从圆柏子中共鉴定出松香酸、柳杉酚、羽扇豆醇、金合欢烯 种萜类化合物。以松香酸为例，在正离子模式下，其保留时间为.，得到 .的准分子离子峰 ，经.软件拟合后推测其分子式为。查阅文献发现，松香酸主要丢失、和开环断裂，形成 .、.、.的碎片离子。质谱图中观察到的 .的分子离子峰，可能是准分子离子丢失一分子 形成；在此基础上，环发生开环裂解，丢失 的碎片离子，形成 .的碎片离子。结合参考文献并与数据库比对，确定该化合物为松香酸。其二级质谱图及可能的裂解规律如图，所示。图 松香酸的二级质谱图图 松香酸的质谱裂解途径.苯丙素类成分的鉴定在圆 柏 子 中 共 鉴 定 出 阿 魏 酸、等 种苯丙素类化合物。以 为 例 分 析，正 离 子 模 式 下，保 留 时 间.一级质谱图中得到.、.、.的分子离子峰，故确定 .为母离子峰，对应的分子式为，在二级碎片离子质谱图中观察到.；.；.的碎片离子峰，查阅数据库和结合相关文献确定此成分为。其二级质谱图见图，可能的裂解途径见图。图 的二级质谱图图 的质谱裂解途径.有机酸类成分的鉴定有机酸类化合物在质谱条件下其碎裂途径主要为丢失、与 等形式。从圆柏子中共鉴定出异维 酸、没食子酸等 种有机酸类化合物。以异维 酸为例分析，在负离子模式下，保留时间.，.的准分子离子峰 ，经 .软件拟合后推测其第 期苟晓玲 等 基于超高效液相色谱四极杆静电场轨道阱高分辨质谱的藏药圆柏子化学成分分析研究书书书表 圆柏子在正负离子模式下化学成分鉴定结果序号（）化学式离子模式测定值（）理论值（）误差（）二级碎片离子信息鉴定结果类别 ；天冬氨酸 ；未知 ；未知 ；水苏碱 ；腺苷 ；没食子酸 ；-；苯基丙氨酸 ；肉桂酸甲酯 ；苯丙氨酸 ；泛酸 ；原花青素 ；原花青素 成都中医药大学学报 年第 卷书书书续表 序号（）化学式离子模式测定值（）理论值（）误差（）二级碎片离子信息鉴定结果类别 ；-；儿茶素 ；阿魏酸 ；表儿茶素 ；未知 ；松柏苷 ；未知 ；（，）-，-（-）-，-；海波拉亭-吡喃葡萄糖苷 ；第 期苟晓玲 等 基于超高效液相色谱四极杆静电场轨道阱高分辨质谱的藏药圆柏子化学成分分析研究书书书续表 序号（）化学式离子模式测定值（）理论值（）误差（）二级碎片离子信息鉴定结果类别 ；芦丁 ；圣草酚-葡糖苷 ；芹菜素-葡萄糖苷 ；，；槲皮苷 ；木犀草苷 ；，；山奈酚 ；，；槲皮素 ；未知 ；木犀草素 ；（）-；-；芹菜素成都中医药大学学报 年第 卷书书书续表 序号（）化学式离子模式测定值（）理论值（）误差（）二级碎片离子信息鉴定结果类别 ；柏木双黄酮 ；穗花杉双黄酮 ；未知 ；霉酚酸 ；新蛇床内酯 ；异维 酸 ；未知 ；甲氧基肉桂醛 ；松香酸 ；柳杉酚 ；羽扇豆醇 ；金合欢烯 ；亚油酰乙醇酰胺注：氨基酸；生物碱类；有机酸类；苯丙素类；黄酮类；萜类；其他；葡萄糖；木糖；鼠李糖第 期苟晓玲 等 基于超高效液相色谱四极杆静电场轨道阱高分辨质谱的藏药圆柏子化学成分分析研究分子式为，其特征二级质谱碎片离子主要有 .、.，通过数据库检索，并与文献比对，确定该化合物的色谱保留时间、质谱裂解规律与异维 酸一致。.生物碱类成分的鉴定圆柏子中共鉴定出水苏碱、等 种生物碱类成分。以水苏碱为例分析：在正离子模式下，在保留时间.得到 .的准分子离子峰 ，经.软件拟合后推测其分子式为，其特征二级质谱碎片离子主要有.、.、.、.、.，通过数据库检索，并与文献比对，确定该成分为水苏碱。.氨基酸类成分鉴定氨基酸类化合物结构中含有氨基和羧基，其质谱中大多数氨基酸易失去 和。从圆柏子中共鉴定出 个氨基酸类化合物。以天冬氨酸为例，在正离子模式下，保留时间.观察到 .的质谱信号，经 .软件拟合后推测其分子式为，其特征二级碎片离子主要有.、.、.、.、.，综上信息与文献报道相结合，确定该化合物的保留时间、裂解规律与天冬氨酸一致。讨论目前，对圆柏子的化学成分定性和定量分析研究较少。本研究首次采用 技术快速、全面地对圆柏子的化学成分进行分析和鉴定。结果共鉴定出柏木双黄酮、松香酸、表儿茶素、柳杉酚、霉酚酸等 种化学成分。其中，槲皮苷、穗花杉双黄酮、柏木双黄酮等成分为圆柏子同源药材圆柏中已发现的成分，而原花青素、异维 酸、圣草酚葡糖苷、芹菜素为首次在圆柏子中鉴定出的成分。圆柏子为藏医常用药材，主要用于治疗肾脏和“黄水”疾病。本研究发现圆柏子中主要含有黄酮类和萜类成分。其中，柏木双黄酮已被证明具有抗炎、镇痛及肾脏保护作用，穗花杉双黄酮具有抗氧化、抗炎作用，槲皮苷可缓解肾纤维化、治疗肾炎，此外，萜类化合物松香酸也被发现具有抗炎作用，柳杉酚具有抗菌、抗氧化、抗炎等多种作用。这些化学成分的生物活性与圆柏子的藏医传统功效紧密相关，因此这些黄酮和萜类成分可能为圆柏子的主要活性成分。今后可进一步结合细胞或整体动物实验，确定圆柏子的药效物质基础。参考文献 国家中医药管理局中华本草编委会 中华本草：藏药卷 上海：上海科学技术出版社，罗尚达 新修晶珠本草 成都：四川科学技术出版社，毛继祖，吉守祥 藏药方剂宝库 兰州：甘肃民族出版社，张姣，德吉，朱孟夏，等 刺柏属 种植物枝叶和果实中挥发性成分分析 中成药，（）：曾彬，刘红梅，刘晓梅，等 技术在中药分析中的应用 中药材，（）：张秋楠，常子豪，叶婷，等 基于 整合网络药理学研究藏药大三果化学成分及作用机制 世界科学技术中医药现代化，（）：苏姗姗，姚志敏，薛宾，等 静电场轨道阱高分辨质谱快速分析唐古红景天的化学成分 中药材，（）：孙燕，冯峰，黄特辉，等 基于 技术结合 数据库快速分析沙棘的功效成分 天然产物研究与开发，（）：易欢，彭芳，谢雨宸，等 法同时测定八味小檗皮胶囊中 种成分的含量 中国药房，（）：，（）：翁倩倩，杨滨，李斌，等 瓜拉纳化学成分的 分 析 中 国 实 验 方 剂 学 杂 志，（）：刘梦诗，杨得坡，杨婉玲，等 基于 技术分析四花青皮的成分 中国医院药学杂志，（）：邹瑾，周金彩，