基于不同还原体系铜纳米颗粒...及其对梨火疫病菌的抗菌性能_陈春利.pdf

农 药AGROCHEMICALS陈春利,胡洋,张楠楠,等.基于不同还原体系铜纳米颗粒的可控制备及其对梨火疫病菌的抗菌性能J.农药,2023,62(7):486-491.doi:10.16820/j.nyzz.2023.2086收稿日期：2023-02-21，修返日期：2023-04-13基金项目：塔里木大学校长基金(TDZKCX202201)；塔里木大学自治区研究生科研创新项目(XJ2022G244)作者简介：陈春利(1996)，男，广西北流人，硕士，研究方向为农药学。E-mail：。通信作者：董红强(1977)，男，甘肃通渭人，教授，研究方向为农药学。E-mail：。基于不同还原体系铜纳米颗粒的可控制备及其对梨火疫病菌的抗菌性能陈春利，胡 洋，张楠楠，纪宇曦，徐瑞川，董红强(塔里木大学 农学院，新疆 阿拉尔 843300)摘要：目的明确3种不同还原体系下制备的铜纳米颗粒对梨火疫病菌(Erwinia amylovora)的抑制效果。方法以乙酸铜为铜前驱体，水合肼、L-抗坏血酸、葡萄糖为还原剂，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)为模板，利用原位还原法制备纳米铜颗粒。通过扫描电子显微镜(SEM)、傅里叶红外光谱仪(FTIR)和牛津能谱仪(EDS)对其结构进行表征，采用生长速率法和田间药效试验测定其对梨火疫病菌的生物活性。结果乙酸铜在3种不同还原剂作用下均制备出了纳米铜颗粒，其中由水合肼还原的纳米铜颗粒平均粒径最小(1307)nm且铜含量最高(83.35%)，对E.amylovora的抗菌效果最好，并且对大白菜未出现药害现象。结论由水合肼还原的纳米铜颗粒具有理想的抗菌活性和植物安全性，对防治梨火疫病菌具有较好的应用前景。关键词：纳米铜颗粒；抗菌活性；梨火疫病；还原剂中图分类号：TQ450.6文献标志码：A文章编号：1006-0413(2023)07-0486-06Controllable preparation and antibacterial activity of coppernanoparticles against Erwinia amylovora basedon different reduction systemsCHEN Chunli,HU Yang,ZHANG Nannan,JI Yuxi,XU Ruichuan,DONG Hongqiang(College of Agronomy,Tarim University,Alar 843300,Xinjiang,China)Abstract:Aims The inhibitory effect of copper nanoparticles prepared from 3 different reduction systems againstErwinia amylovora was determined.Methods Copper nanoparticles were facilely prepared by in-situ reduction methodthrough selecting copper acetate as the copper precursor,hydrazine hydrate,L-ascorbic acid and glucose as the reducingagent,and polyvinyl pyrrolidone(PVP)as template.The synthesized copper nanoparticles were characterized byscanning electron microscopy(SEM),Fourier infrared spectrometer(FTIR)and Oxford energy dispersive spectrometer(EDS),and their bioactivity against E.amylovora was determined by growth rate method and field experiments.Results The copper nanoparticles were prepared by reduction of cupric acetate with 3 different reducing agents,among which the copper nanoparticles reduced byhydrazine hydrate had the smallest average particle size of(1307)nmandthehighestcoppercontent(83.35%),whoseantibacterialabilityagainst E.amylovora wasthebest,andnophytotoxicityto Chinese cabbage.Conclusions The copper nanoparticles reduced by hydrazine hydrate have ideal antibacterialactivity and plant safety,and have a good application prospect for the control of pear fire blight.Key words:copper nanoparticle;antibacterial activity;pear fire blight;reducing agent梨火疫病是由解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)引起的一种极具毁灭性的细菌性病害，可危害包括梨、苹果、海棠等植物1-5。梨火疫病传播极为迅速，流行严重时在短短几周内就可从发病的花、嫩梢、叶片和幼果扩展到主枝和主干上，导致花果凋零，甚至整株死亡，果园被毁，造成严重的经济损失6。但该病害防治难度大，至今仍未得到很好的控制，而使用化学药剂是目前防控梨火疫病最为普遍和有效的手段之一。随着农用链霉素、叶枯唑的禁用，铜制剂因其具有杀细菌效果好、低成本和易获取等优点，逐渐成为防治梨火疫病的主要药剂之一7-9。目前，市场上铜制剂主要以不溶性铜化合物为主(如氢氧化铜、喹啉铜、氧化亚铜、噻二唑铜等)，在生产中因其有效利用率低导致单次使用量大，易产生植物药害和重金属污染问题9-17。因此，如何提高铜制剂有效利用率和降第62卷第7期2023年7月Vol.62,No.7Jul.2023第7期低对植物的毒害作用已成为铜制剂研究的热点。与传统药物相比，纳米药物因具有小尺寸效应、宏观量子隧道效应、表面与界面效应和量子尺寸效应等特征，具有比一般农药更为优异的理化性质，从而提高药物的溶解度和吸收率，降低药物使用量，减少毒害作用，提高环境相容性18-19。有研究表明，纳米金属化合物比微米级金属化合物具有更高的抗菌活性20-24。此外，与其他抗菌金属相比，纳米铜颗粒具有较低的毒性，较大的比表面积和广谱的抗菌活性等优点，在防治梨火疫病害方面具有广阔的发展前景25-27。然而，纳米铜颗粒具有不稳定性、易团聚和易氧化等缺点。为了防止纳米铜颗粒的团聚和氧化，试验以乙酸铜为铜前驱体，水合肼、L-抗坏血酸、葡萄糖为还原剂，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)为模板，利用原位还原法制备纳米铜颗粒，通过扫描电子显微镜、傅里叶变换红外光谱和牛津能谱仪进行表征，确定了其形貌、含量和尺寸等理化性质；通过生长速率法测定其对梨火疫病菌的抗菌活性，并进行安全性评价。旨在筛选出一种安全、高效防治梨火疫病的杀菌剂。1材料与方法1.1试验材料供试菌株梨火疫病菌(Erwinia amylovora)由新疆阿拉尔市塔里木大学植物病理实验室提供；乙酸铜(99%，天津市光复精细化工研究所)；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(99%，北京索莱宝科技有限公司)；L-抗坏血酸(AR，国药集团化学试剂有限公司)；水合肼(80%，天津市鼎盛鑫化工有限公司)；D-葡萄糖(AR，上海山浦化工有限公司)；氨水(AR，四川西陇科学有限公司)；乙烯二胺四乙酸(EDTA)(99.5%，天津市致远化学试剂有限公司)。1.2主要试验仪器水浴锅(SB-2000，上海爱朗仪器有限公司)；台式高速离心机(H2-16K，湖南可成仪器设备有限公司)；磁力搅拌器(金坛区西城新瑞仪器厂)；扫描电子显微镜(德国-蔡司-ZEISS Sigma500)；牛津仪器X射线能谱仪(OXFORDUltim Extreme EDS)；傅里叶变换红外分光光度计(FTIR)。1.3纳米铜颗粒的制备1.3.1L-抗坏血酸-纳米铜的制备L-抗坏血酸-纳米铜的制备参考文献方法稍作修改28。称取0.02 mol乙酸铜，用100 mL去离子水配制成浓度为0.2 mol/L的水溶液(溶液A)。以Cu2+与PVP质量比为12称取2.54 g PVP溶解于100 mL去离子水中，以乙酸铜与抗坏血酸摩尔比为13称取0.06 mol抗坏血酸加入到PVP水溶液中，配成还原剂+保护剂的混合水溶液(溶液B)。将溶液B搅拌并加热至80，调节pH至3。将溶液A缓慢滴加到溶液B中，反应1 h。通过离心获得L-抗坏血酸-纳米铜，用去离子水超声清洗3次，再用无水乙醇清洗2次，并在真空干燥箱中干燥。1.3.2葡萄糖-纳米铜的制备取5 mL PVP(浓度为0.8 mol/L)溶液加入到葡萄糖(0.04 mol、40 mL)溶液中，记为溶液C；取5 mL PVP(浓度为0.8 mol/L)溶液加入到乙酸铜(0.1 g、50 mL)溶液中，记为溶液D。将溶液C逐滴加入到溶液D中，调节pH至10，80 水浴加热30 min，反应结束。通过离心获得葡萄糖-纳米铜，用去离子水超声清洗3次，再用无水乙醇清洗2次，并在真空干燥箱中干燥。1.3.3水合肼-纳米铜的制备水合肼-纳米铜的制备参考文献方法稍作修改29。取0.05 mol乙酸铜加入到去离子水(100 mL)中，室温搅拌至完全溶解，然后依次加入EDTA(3 g)和PVP(2 g)，记为溶液E；配制水合肼和氨水物质的量比为11的水合氨溶液，记为溶液F(100 mL)。E和F溶液在60 水浴中加热30 min，调节溶液E的pH至12。在磁力搅拌器下，将溶液F缓慢加入到溶液E中。随着反应的进行，溶液的颜色从蓝色变化到蓝绿色、黄绿色、黄棕色、深红色直至紫红色，反应结束。通过离心获得水合肼-纳米铜，用去离子水超声清洗3次，再用无水乙醇清洗2次，并在真空干燥箱中干燥。1.4特征描述使用扫描电子显微镜对L-抗坏血酸-纳米铜、葡萄糖-纳米铜和水合肼-纳米铜的形貌进行了表征；使用牛津仪器X射线能谱仪对样品元素组成与含量进行了表征；使用傅里叶变换红外分光光度计(FTIR)对乙酸铜、PVP和纳米铜的官能团变化进行了表征，并确定纳米铜颗粒是否合成。1.5体外抗菌试验3种由不同还原剂制备的纳米铜颗粒对梨火疫病菌的抑菌活性测定采用抑菌圈法30-31。取梨火疫病菌菌液200 L涂布于固体LB平板上。在平板上放置4片直径为8 mm的滤纸片，分别加入10 L质量浓度为400 mg/L的纳米铜悬浮液，以无菌水作空白对照，每个处理设3次重复。置于28 恒温培养箱中培养24 h后观测抑菌圈直径，并根据以下公式计算抑菌率：抑菌率(%)=处理组直径-对照组直径处理组直径100最小抑菌浓度(MIC)的测定采用培养基稀释法32。分别将含有不同质量浓度纳米铜悬浮液(50、100、200、400、800 mg/L)的LB液体培养基10 mL倒入已灭菌的50 mL离陈春利，等：基于不同还原体系铜纳米颗粒的可控制备及其梨火疫病菌的抗菌性能487农 药 AGROCHEMICALS第卷62心管中，所有浓度均由Cu2+的质量确定，再加入200 L已活化的梨火疫病菌菌液(约1108CFU/mL)，以Cu2+作阳性对照，另设不含药的LB液体培养基作空白对照(CK)。在28、220 r/min下摇培18 h，各取摇培液