贫铀通过内质网应激诱导甲状腺损伤_舒畅.pdf

doi:1011659/jjssx12E022009基础研究贫铀通过内质网应激诱导甲状腺损伤舒畅，赵雅贞，李杰，焦露，柳随义，李勇，李娟，冉永红，郝玉徽(陆军军医大学军事预防医学系复合伤研究所，重庆 400038)摘要 目的探究贫铀(DU)诱导甲状腺损伤的机制，并探索其防治方法。方法将大鼠甲状腺细胞 FTL-5 分别用500 mol/L的贫铀溶液作用不同时间，用 CCK-8 法检测细胞活力。将 FTL-5 细胞暴露于不同浓度的贫铀，用 Annexin V-FITC/PI染色法检测细胞凋亡情况，用 Western blot 检测葡萄糖调节蛋白 78(GP78)的表达，用免疫荧光染色法检测转录激活因子6(ATF6)的表达。将 FTL-5 细胞暴露于 500 mol/L 的 4-苯基丁酸(4-PBA)，用 CCK-8 法检测细胞活力。将 FTL-5 细胞分为对照组、DU组和4-PBA+DU 组，分别进行相应的处理后，用 CCK-8 法检测细胞活力。结果贫铀导致了 FTL-5 细胞活力下降和细胞凋亡;贫轴诱导 FTL-5 细胞 GP78 和 ATF6 表达增加;500 mol/L 的 4-PBA 对 FTL-5 细胞的活力没有影响;4-PBA 预处理缓解了贫轴诱导的细胞活力的下降。结论贫铀通过内质网应激诱导甲状腺细胞损伤，靶向内质网应激的治疗可能具有缓解贫铀导致的甲状腺损伤的作用。关键词贫铀;内质网应激;甲状腺;细胞凋亡 中图分类号595 文献标识码A 收稿日期2022-12-01 基金项目国家自然科学基金项目(81972972);军队后勤科研重点项目(BLJ20J005)通信作者郝玉徽，E-mail:yuhui_hao126 comDepleted uranium causes thyroid damage through endoplasmic reticulum stressSHU Chang，ZHAO Ya-zhen，LI Jie，QIAO Lu，LIU Sui-yi，LI Yong，LI Juan，AN Yong-hong，HAO Yu-hui(Institute ofCompound Injury，Department of Military Preventive Medicine，Army Medical University，Chongqing 400038，China)Abstract:ObjectiveTo explore the mechanism of depleted uranium(DU)induced thyroid damage，and the rapeutic methods forprotection of thyroid from depleted uranium MethodsFischer rat thyroid cell line-5(FTL-5)cells were exposed to depleted uranium(500 mol/L)for different time，and the cell viability was detected by CCK-8 assay FTL-5 cells were exposed to different concentrationsof depleted uranium，then Annexin V-FITC/PI staining was used to observe the cell apoptosis，Western blot was used to detect the expressionof glucose-regulated protein 78(GP78)，and immunofluorescent staining was used to detect the expression of activating transcription factor 6(ATF6)FTL-5 cells were exposed to 500 mol/L 4-phenylbutyric acid(4-PBA)，the cell viability was detected by CCK-8 assay FTL-5cells were divided into Control group，DU group and 4-PBA+DU group，and the cell viability of FTL-5 cells was detected by CCK-8 assayafter corresponding treatment esultsDepleted uranium decreased the viability of FTL-5 cells and increased the apoptosis of FTL-5cells Depleted uranium induced an increased expression of GP78 and ATF6 in FTL-5 cells 4-PBA(500 mol/L)had no effect on theviability of FTL-5 cells 4-PBA alleviated the decline of cell viability caused by depleted uranium ConclusionDepleted uranium causesthe damage to thyroid cells through endoplasmic reticulum stress，and therapy targeting endoplasmic reticulum stress may alleviate the thyroiddamage caused by depleted uraniumKeywords:depleted uranium;endoplasmic reticulum stress;thyroid;apoptosis铀(uranium)是一种在自然界广泛存在的金属元素。天然铀主要由234U、235U 和238U 组成，其丰度分别为 0 01%、0 71%和 99 28%，具有重金属属性和一定的放射性1。贫铀(depleted uranium，DU)是天然铀浓缩产生的副产品，其化学性质与天然铀相似，放射性为天然铀的 60%2。贫铀具有密度高、韧性强、穿透力好等物理性质，常被应用于军事装备，如贫铀穿甲弹、贫铀防护装甲等3。贫铀在民用活动中也比较常见，如核电燃料的生产会产生大量的贫铀，牙科烤瓷冠中使用的荧光添加剂含有贫铀，医院 X 射线屏蔽材料含有贫铀，商用飞机以及游艇内的建造材料等也需要贫铀 3。贫铀是一种新型的污染物 3。20 世纪 90 年代，在一场军事行动中，贫铀武器被大量应用，当地环境中贫铀的含量急剧增加，导致参战人员和当地居民产生了一种称为“波斯湾综合症”的症状 4，贫铀因对环境和健康的影响而被人们所关注。贫铀会对人体产生明显的损伤，研究证明，贫铀可通过呼吸道、消化道、受损的皮肤等途径进入体内，并沉积于多个部位，引起相应的症291局解手术学杂志J EG ANAT OPE SUG2023，32(3)http:/www jjssxzz cn状 3。目前的研究主要关注贫铀对肾的损伤，其次是骨骼、肝和肺等 2，而贫铀对甲状腺的损伤关注较少。甲状腺是人体重要的内分泌器官，其分泌的甲状腺激素作用于全身的各个组织，对于人体的生长发育和生理功能具有重要作用。甲状腺功能障碍会引起生长发育迟滞、神经发育障碍、代谢紊乱和多种生理功能不全，最终可导致呆小症、甲状腺功能亢进或者甲状腺功能减退等疾病，严重影响患者健康5。然而，甲状腺是一个对环境因素特别敏感的器官。有研究显示，镉和铬等多种重金属可导致甲状腺破坏性改变，引起甲状腺功能障碍，进而引发一系列的症状6-7。铀暴露也可能会引起某些甲状腺相关疾病的发生8。研究显示，铀暴露会导致斑马鱼的甲状腺损伤，引起甲状腺激素水平发生变化9。因此，甲状腺是贫铀损伤的重要靶器官之一。但是，目前未见关于贫铀致甲状腺损伤机制的研究。本研究使用大鼠甲状腺细胞 FTL-5初步探索了贫铀导致甲状腺损伤的机制，为贫铀致机体损伤的防治寻找可能的治疗靶点。1材料与方法1 1主要试剂贫铀溶液的制备:制作贫铀溶液的材料来源和配制方法同郝玉徽等10 的研究，配制的贫铀溶液浓度为2 mg/mL，过滤灭菌，于 4 保存，备用。大鼠甲状腺细胞 FTL-5(上海盈湾生物科技有限公司)。4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid，4-PBA)、Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒(Med-ChemExpress，美国)。兔源葡萄糖调节蛋白 78(glucose-regulated protein 78，GP78)、转录 激 活 因 子 6(activating transcription factor 6，ATF6)抗体(abcam，英国)，-actin 抗体(Cell SignalTechnology，美 国)。IPA 裂 解 液、苯 甲 基 磺 酰 氟(PMSF)、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG(H+L)、超敏 ECL 化学发光试剂盒、PBS 粉剂、Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒、4%多聚甲醛固定液、免疫染色通透液(Triton X-100)、抗荧光淬灭封片液(含 DAPI)、FITC 标记山羊抗兔 IgG(H+L)(上海碧云天生物技术有限公司)。DMEM 培养基、青霉素、链霉素和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(Gibco，美国)。山羊血清封闭液(北京中杉金桥生物技术有限公司)。1 2实验方法1 2 1细胞培养将大鼠甲状腺细胞 FTL-5 培养于含10%(体积分数)的 FBS、100 kU/L 的青霉素和100 mg/L 的链霉素的 DMEM 中，置于 37、5%CO2的细胞培养箱中培养。取生长状态良好的细胞用于实验。1 2 2CCK-8 法检测细胞活力将 FTL-5 细胞培养于 96 孔板，每组设置 3 个重复样本。按照 CCK-8检测试剂盒说明书进行操作。将细胞进行相应处理后，弃去旧的培养基，在每孔加入含 10%CCK-8 的新培养基 100 L，孵育1 4 h 后，检测450 nm 波长处的OD 值。细胞活力=(OD实验组 OD空白组)/(OD对照组OD空白组)。1 2 3细胞凋亡检测流式细胞仪检测细胞凋亡情况。每组设置 3 个重复样本，将细胞分别用 0、125、250、500 mol/L 的贫轴溶液处理 24 h，然后收集细胞，按照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作。每样本加入 195 L 的 Annexin V-FITC 结合液，轻轻重悬细胞，然后加入 5 L 的 Annexin V-FITC，混 匀。再 加 入 10 L 碘 化 丙 啶(propidiumiodide，PI)染色液，混匀后，室温避光孵育 20 min，冰浴、避光。孵育过程中重悬细胞3 次。样本通过 C6 流式细胞仪(BD Biosciences，SanDiego，CA)进行分析。用 FlowJo 软件(Verse10 4 0)定量分析数据。原位免疫荧光检测细胞凋亡情况。按照 AnnexinV-FITC 细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作。每组设置 3 个重复样本，将处理后的细胞 1 000 g 离心5 min。吸除培养液，用 PBS 洗涤 1 次，再次1 000 g 离心 5 min，吸除 PBS。每样本依次加入 195 L 的Annexin V-FITC 结 合 液、5 L 的 Annexin V-FITC、10 L的 PI 染色液，轻轻摇匀。室温避光孵育 20 min，然后避光冰浴。随即在荧光显微镜(DM3000 LED;Leica