木薯MeSAUR1互作蛋白的筛选及鉴定_郑婉茹.pdf

分子植物育种，2023 年，第 21 卷，第 14 期，第 4659-4665 页Molecular Plant Breeding,2023,Vol.21,No.14,4659-4665研究报告Research Report木薯 MeSAUR1 互作蛋白的筛选及鉴定郑婉茹1,2丁凯旋4陆小花1,3王睿1,2陈银华1,2姚远3陈新3耿梦婷1,2*1 海南大学热带作物学院,海口,570228;2 海南大学热带作物学院,海南省热带生物资源可持续利用国家重点实验室培育基地,海口,570228;3 中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海口,571101;4 海南省种子总站,海口,571100*通信作者,摘要木薯 MeAGPS1a 基因编码的小亚基是淀粉合成关键酶 AGPase 的催化中心，前期研究发现 MeSAUR1转录因子可结合 MeAGPS1a 基因启动子并调控该基因表达。采用酵母双杂交技术筛选 MeSAUR1 转录因子的互作蛋白，可进一步解析 MeAGPS1a 基因表达的分子调控网络。本研究构建了 MeSAUR1 的酵母双杂交诱饵载体 pGBKT7-MeSAUR1，采用酵母双杂交技术从木薯 cDNA 文库中筛选 MeSAUR1 的候选互作蛋白，结果共筛选出 31 个阳性克隆。通过酵母双杂交点对点实验验证了候选互作蛋白 MePP2C 与 MeSAUR1 的互作关系，本研究结果有助于揭示 MeSAUR1 蛋白调控木薯淀粉合成的互作网络。关键词木薯;MeSAUR1;酵母双杂交;互作蛋白Screening and Identification of MeSAUR1 Interacting Protein in CassavaZheng Wanru1,2Ding Kaixuan4Lu Xiaohua1,3Wang Rui1,2Chen Yinhua1,2Yao Yuan3Chen Xin3Geng Mengting1,2*1 College of Tropical Crops,Hainan University,Haikou,570228;2 Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bioresources,Col-lege of Tropical Crops,Hainan University,Haikou,570228;3 Institute of Tropical Biotechnology,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Haikou,571101;4 Hainan Seed Station,Haikou,571100*Corresponding author,DOI:10.13271/j.mpb.021.004659AbstractThe small subunit encoded by MeAGPS1a gene is the catalytic center of AGPase in cassava,andAGPase is a key enzyme in starch synthesis.Previous studies have found that MeSAUR1 transcription factor canbind to the promoter of MeAGPS1a gene and regulate its expression.Screening the interacting protein of MeSAUR1transcription factor by yeast two-hybrid technology can further analyze the molecular regulatory network ofMeAGPS1a gene expression.The yeast two-hybrid vector pGBKT7-MeSAUR1 of MeSAUR1 was constructed inthis study,and the candidate interacting proteins of MeSAUR1 were screened from cassava cDNA library by yeasttwo-hybrid technology,and 31 positive clones were screened.The interaction between candidate interacting pro-tein MePP2C and MeSAUR1 was verified by yeast two-hybrid point-to-point experiment.The results of this studyare beneficial to reveal the interacting network of MeSAUR1 protein regulating starch synthesis in cassava.KeywordsManihot esculenta;MeSAUR1;Yeast two-hybrid;Interact protein基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(No.31960058)和海南省研究生创新科研课题(No.Hys2020-140)共同资助引用格式：Zheng W.R.,Ding K.X.,Lu X.H.,Wang R.,Chen Y.H.,Yao Y.,Chen X.,and Geng M.T.,2023,Screening and iden-tification of MeSAUR1 interacting protein in cassava,Fenzi Zhiwu Yuzhong(Molecular Plant Breeding),21(14):4659-4665.(郑婉茹,丁凯旋,陆小花,王睿,陈银华,姚远,陈新,耿梦婷,2023,木薯 MeSAUR1 互作蛋白的筛选及鉴定,分子植物育种,21(14):4659-4665.)木薯(Manihot esculenta Crantz)是大戟科(Eu-phorbiaceae)的一种块根作物，具有高光效、高淀粉产量、抗旱、耐瘠薄等特性，是世界上第六大粮食作物(Zidenga et al.,2012)，与马铃薯、红薯并列为世界三分子植物育种Molecular Plant Breeding大薯类作物(Ceballos et al.,2004)，也是中国重要的工业和生物源原料(Zhang et al.,2010)。AGPase 是植物淀粉合成的关键酶和限速酶，其催化 G-1-P 和ATP 生成 ADPG 和 PPi，ADPG 是淀粉生物合成的底物(Lee et al.,2007)。木薯 MeAGPS1a 基因编码的小亚基是淀粉合成关键酶 AGPase 的催化中心。本实验室前期研究发现，生长素响应因子 MeSAUR1 可结合 MeAGPS1a 基因翻译起始位点上游-201400 bp的启动子区，并正调控 MeAGPS1a 基因表达(Ma etal.,2017)。生长素是植物发育主要激素之一(Santnerand Estelle,2009)，SAUR(Small Auxin-Up RNA)是生长素响应因子中最大的一类。Spartz 等(2012)研究认为 SAUR 主要参与调节生长素的合成与运输，影响细胞膨大，进而改变植株形态。为了进一步解析MeSAUR1 调控 MeAGPS1a 基因表达的分子机理，本研究酵母双杂交系统筛选 MeSAUR1 的候选互作蛋白，并通过酵母双杂交点对点验证 MeSAUR1 及其互作蛋白的互作关系，丰富木薯淀粉合成调控网络，为木薯分子育种提供新的基因资源。1结果与分析1.1 pGBKT7-MeSAUR1诱饵载体的构建设计特异性引物，以中国木薯主栽品种 SC8 的cDNA 为模板，RT-PCR 扩增 MeSAUR1 基因的编码区序列。电泳检测结果显示扩增片段与预期大小(318bp)一致。将 MeSAUR1 基因与线性化的 pGBKT7载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞。挑取 7 个单菌落进行菌落 PCR 鉴定，获得阳性克隆并进行测序验证(图 1)，提取测序正确的 pGBKT7-MeSAUR1 诱饵载体，备用于酵母双杂交文库筛选。1.2 pGBKT7-MeSAUR1的自激活检测将 pGBKT7-MeSAUR1(简写:BD-MeSAUR1)和pGADT7(简写 AD)质粒共转 AH109 酵母感受态细胞进行自激活检测。在 SD/TL 培养基上，共转BD-MeSAUR1 和 AD 的酵母菌和阳性对照(AD-T+BD-p53)的酵母菌均能正常生长，但在 SD/TLHA 培养基上只有阳性对照生长，且阳性对照在 SD/TLHA+X-Gal 平板上酵母菌落变蓝，而共转 BD-MeSAUR1和 AD 的酵母菌和阴性对照(AD-T+BD-lam)不生长。此结果表明 MeSAUR1 蛋白不具有自激活活性，可用于酵母双杂交筛选木薯 cDNA文库(图 2)。1.3木薯MeSAUR1互作蛋白的筛选及鉴定将本实验室前期制备的木薯酵母双杂交质粒文库大规模转化到含有诱饵载体 BD-MeSAUR1 的AH109酵母感受态。转化后的酵母菌液涂布于 SD/THL+5mmol/L3-AT 固体培养基上培养，共获得 31 个酵母单克隆。挑取单克隆酵母菌斑在 SD/TLHA+X-Gal 培养基上划线，变蓝的阳性菌落用于 PCR检测。菌落 PCR 获得的条带大小集中在 5001 000 bp之间(图 3)。将菌落 PCR 产物送上海生工测序，测序结果在phytozome 数据库中进行 BLAST 检索，得到 Me-SAUR1 的候选互作蛋白 31 个(表 1)。根据基因功能注释结果，挑选出蛋白磷酸酯酶 2C(MePP2C)进行点对点互作验证。1.4 MePP2C基因的克隆根据 phytozome 数据库中获得的 MePP2C 信息(基因组编号:Manes.04G071500)，以 SC8 木薯品种的 cDNA 为模板，采用 RT-PCR 方法扩增 MePP2C基因的编码区(图 4)。经测序分析，MePP2C 的编码区图 1 菌落 PCR 筛选阳性克隆注:M:DL2000 DNA Marker;17:单菌落Figure 1 Colony PCR screening for positive clonesNote:M:DL2000 DNA Marker;17:Single colony图 2 pGBKT7-MeSAUR1 自激活检测注:AD-T+BD-p53:阳性对照的生长情况;AD-T+BD-lam:阴性对照的生长情况;1,110-1,110-2,110-3为酵母菌液的原液及不同稀释倍数;TL:二缺培养基;TLHA:四缺培养基Figure 2 pGBKT7-MeSAUR1 self activation testNote:AD-T+BD-p53:Growth condition of Positive control;AD-T+BD-lam:Growth condition of Negative control;1,110-1,110-2,110-3were the original solution and different dilutionmultiples of yeast solution,the same as below;TL:Two deficientmedium:TLHA:Four deficient medium4660长度为 1 194 bp，可编码 397 个氨基酸。1.5 MePP2C的理化性质分析利用 ExPASy(https:/web.expasy.org/protparam/)对木薯 MePP2C 蛋白的生