纳米复合载体固定酪氨酸酶合成左旋多巴_汪定林.pdf

第36卷第4期,2023年7月 宁 波 大 学 学 报（理 工 版）中国科技核心期刊 Vol.36 No.4,July 2023 JOURNAL OF NINGBO UNIVERSITY(NSEE)中国高校优秀科技期刊 DOI:10.20098/ki.1001-5132.2022.1023 纳米复合载体固定酪氨酸酶合成左旋多巴 汪定林,张瑞丰*（宁波大学 材料科学与化学工程学院,浙江 宁波 315211）摘要:利用模板法制备大孔 SiO2材料,而后借助水热合成法在孔道中生长 ZnO 纳米线,得到新型纳米复合材料(SiO2/ZnO NWs).采用静电吸附法将酪氨酸酶(TYR)固定在纳米复合载体上,用于 L-多巴合成.从扫描电子显微镜中观察到 ZnO 纳米线在孔道中呈现无规线团形貌,且分布均匀.TYR在 SiO2/ZnO NWs 上的最大负载量高达 162.3mgg-1,约是纯大孔 SiO2载体3 倍,且远高于其他固定化 TYR 系统.利用固定化 TYR 进行 L-多巴合成,在最优反应条件(35、pH6.0、L-抗坏血酸浓度10 mmolL-1)下催化 1.5h,L-多巴的产率可达 70.2.固定化 TYR展现良好的储存稳定性,储存 28d 仍保持 78.6的相对活性,远高于游离状态 TYR,并可重复使用,经历 10个循环后仍能保持 42.1的 L-多巴产率.关键词:纳米复合材料;酪氨酸酶;固定化酶;左旋多巴 中图分类号:TQ464.8 文献标志码:A 文章编号:1001-5132（2023）04-0033-09 L-多巴作为人体大脑中神经递质多巴胺的前体物质,可以穿过大脑中的血脑屏障转化为多巴胺,故其成为治疗帕金森病(一种因神经递质多巴胺含量降低的神经变性疾病)最有效的药物.据研究1,每年全球 L-多巴市场规模约 250t,总容量1.011011 t,其中大部分都是通过化学合成工艺生产,但化学工艺生产存在程序复杂、催化剂昂贵、转化率低等问题2.考虑到生物合成可能是化学合成工艺有前景的替代方法,近年来采用生物合成L-多巴研究不断升温.文献3-5报道了利用微生物法(如酵母、细菌和真菌)对目标产物进行合成,但该方法缺点明显,如对细胞生长过程中所需碳源要求苛刻、合成周期长(包含细胞培养期,一般在10d 以上)、价格昂贵(产物的纯化需要去除细胞产生的激素和蛋白质)等;由于酪氨酸酶(TYR)工艺(以 TYR 为催化剂)从 L-酪氨酸转化为 L-多巴可在数小时内完成,产物转化率较高,且不需要进行纯化,因此 TYR 逐渐成为合成 L-多巴酶促路线的主角6.然而游离 TYR 重复使用性差、稳定性低、成本高等不足阻碍了其应用7.固定化酶是解决这些问题的有效方式8-9.固定化酶载体对固定化酶特性有决定性作用,因此选择合适的载体意义重大.近年来,介孔二氧化硅因其比表面积大、可调节孔隙面积和大小,因而在固定化酶领域备受关注10-11.这些材料借助物理或化学方法负载大量的酶,同时孔隙为酶分子提供了抵抗酸碱、温度和高盐浓度的有利环境12-14.但是酶分子被限制在介孔或较小孔中会出现明显的传质阻力,导致酶活性降低15.而通过增加载体孔径大小(如介孔到大孔),可以预期底物的扩散速率会增加,且酶分子在孔穴内会具有更高的灵活性,从而产生更高的酶活.之前我们已通过模板法制备出一种三维大孔SiO2载体,具有高孔隙率(93)、低密度,以及热、化学和机械稳定性良好的优点16-18.但 SiO2骨架呈现电子中性,会导致严重的酶泄漏问题19,同时比表面积小限制其应用.这也是纯大孔 SiO2被用于固定化酶载体鲜有报道的一个原因.针对该问 收稿日期:20221031.宁波大学学报（理工版）网址:http:/ 34 宁波大学学报（理工版）2023 题,我们尝试了将 ZnO 纳米线与大孔 SiO2相结合得到纳米复合材料,以解决单一材料带来的不足.ZnO 纳米线的引入不仅增大了载体的比表面积,而且因其高等电点(9.50)赋予载体正电荷特性,有利于生物酶分子的固定化.此外,ZnO 热稳定性好,在高温环境下其化学和形态能保持不变,所以只需通过高温煅烧就能去除被载体吸附的有机化合物,从而实现载体的重复使用,避免其他固定化系统繁琐的表面修饰.本文通过一种特殊的水热合成方法,在大孔SiO2中原位生长 ZnO 纳米线制备一种大孔 SiO2/ZnO纳米线的复合材料(SiO2/ZnO NWs),由于ZnO纳米线的结构为开放型,因此不会出现底物和酶被孔壁隔离的情况,从而可以避免传质限制.使用X 射线衍射仪(XRD)和扫描电子显微镜(SEM)对材料的结构以及形貌进行表征,并以此作为静电吸附 TYR 的载体,得到生物催化剂(SiO2/ZnO NWs-TYR),将其应用于 L-酪氨酸合成 L-多巴的催化反应.系统考察酶溶液浓度和pH值对TYR负载量的影响,并对固定化条件进行优化,以此探究 L-抗坏血酸(催化反应所需的还原剂)的用量、反应时间,以及不同 pH 值和温度对固定化 TYR 合成 L-多巴的影响,研究固定化 TYR 的储存稳定性以及可重复性.1 材料与方法材料与方法 1.1 纳米复合载体纳米复合载体的制备的制备 1.1.1 大孔 SiO2的制备 称取 28.0g 聚乙二醇(PEG1000)、16.0g 双酚 A型环氧树脂和 4.0g 聚乙二醇(PEG2000)于烧杯中,边加热边搅拌,同时迅速加入 4.0g 固化剂(二乙烯三胺),混合均匀后 70固化 3h,得到白色块状物重复浸泡在清水中,达到去除PEG的目的.而后在常温真空环境下进行干燥,得到一种具有三维骨架的聚合物模板.将模板浸泡于正硅酸四乙酯中3h,完全湿润,接着取出模板,并在 30 下熏氨12h,使正硅酸四乙酯充分水解为 SiO2.最后取出复合物,60干燥 2h,在马弗炉中设置 10min-1速率升温至 800煅烧,去除聚合物后获得与模板尺寸、外形相同的大孔 SiO2材料.具体步骤可参见文献16.1.1.2 ZnO 纳米线在大孔 SiO2孔道内的水热生长 ZnO 纳米线的原位生长可分两步完成.(1)ZnO晶种在大孔 SiO2孔壁原位形成:将大孔 SiO2浸泡在 PEG600、Zn(Ac)22H2O 以及水混合溶液 3h,取出置于 100干燥箱中干燥 1 h,烘干水分,PEG600仍存留于孔道中;接着在马弗炉(200)下持续煅烧 1h,使 Zn(Ac)2充分水解为 ZnO;然后设置7.5 min-1升温速率,达到 650,恒温 20min,除去有机物.(2)ZnO 纳米线的生长:Zn(NO3)26H2O溶入过量氨水,得到 1molL-1的 Zn 源溶液,将步骤(1)得到的已植入 ZnO 晶种大孔 SiO2材料浸泡6h 后取出,置于密闭容器中发生水热反应;反应容器中提前放置经硫酸溶液浸泡的硅胶,以吸收反应过程中产生的氨气;水热反应先在 90 下持续反应6h,然后温度升至100持续反应12h;载体在反应结束后自然冷却再取出,经清水浸泡、自然干燥,即得到 SiO2/ZnO NWs 载体材料(图 1).图 1 大孔 SiO2中原位生长 ZnO NWs 示意图 1.2 酪氨酸酶在复合载体上的固定酪氨酸酶在复合载体上的固定 通过静电吸附法将酪氨酸酶固定在复合载体上(图 2).控制 pH 值介于 TYR等电点(5.92)和 ZnO纳米线等电点(9.50)之间,TYR 将带有负电荷,因此 TYR可以被富集和吸附在 ZnO 纳米线上.此外,ZnO 纳米线的结构为开放型,因此不会出现底物和酶被孔壁隔离的情况,从而避免了传质限制.具体操作如下:将适量的酪氨酸酶冻干粉加入 20mL 0.2 molL-1磷酸盐缓冲液中(pH7.0),配置一系列不同浓度的酶溶液;然后将混合物持续摇动 20 min,25离心 10min,用移液枪收集上清液,得到酪氨酸酶溶液.将 0.2g 复合载体与大孔 SiO2分别切成2 mm2 mm2 mm的块状;随后置于15 mL不同质100200 H2O/Zn(Ac)2/PEG600 PEG600 植入晶种 Zn(OH)2 水热反应 100 200650 第 4 期 汪定林,等:纳米复合载体固定酪氨酸酶合成左旋多巴 35 量浓度(0.54.0gL-1)酪氨酸酶溶液中浸泡5h以上,温度控制在 15;之后使用缓冲溶液和去离子水对样品进行洗涤,最后将固定化酪氨酸酶置于 4冰箱中储存备用.1.3 酶载酶量测定酶载酶量测定 该体系的载酶量指单位质量 SiO2/ZnO 纳米线的复合载体固定化酪氨酸酶的含量.利用固定化实验前后酪氨酸酶浓度差计算该值,根据 Bradford法20,载酶量的计算公式为:121320(),CC VC VPm-=(1)式中:P0为载体的载酶量,mgg-1;C1为固定化前TYR溶液质量浓度,gL-1;C2为固定化后TYR溶液质量浓度,gL-1;C3为清洗样品所用缓冲溶液中TYR 溶液的质量浓度,gL-1;V1为固定化实验加入的 TYR 溶液体积,mL;V2为清洗样品所用缓冲溶液的体积,mL;m 为进行固定化实验的载体材料质量,g.为探究载体吸附稳定性,将 SiO2/ZnO NWs-TYR 和 SiO2-TYR 置于 30 mL 磷酸盐缓冲溶液(0.1 mmol,pH7.0)持续浸泡搅拌一段时间,取出样品,测定缓冲溶液中 TYR 浓度,计算酶的泄漏量.剩余酶量计算公式为:0/,ttPPCVm=-(2)式中:Pt为经浸泡固定时间后的载酶量,mgg-1;Ct为浸泡样品一段时间后 TYR 溶液质量浓度,gL-1;V 为浸泡样品所用缓冲溶液的体积,mL.1.4 酪氨酸酶活性测定酪氨酸酶活性测定 酪氨酸酶活性以 L-多巴为反应底物,利用分光光度法进行测定.具体操作为:首先将L-多巴溶液(0.8 mL,10 mmolL-1)与磷酸缓冲溶液(2.1 mL,0.1 molL-1,pH7.0)混合,通入氧气 1 min,然后添加含游离酪氨酸酶 0.1mg 溶液 0.1 mL,或载酶量0.1 mg 的固定化酶,持续摇荡 1 min,借助 UV-2600 紫外分光光度计(岛津企业管理有限公司)检测并记录波长 475nm 处吸光度.固定化酶实验组活性检测大体同上,不同在于反应液检测前需迅速分离出固定化酶,因此 1min 内产生 1mol 多巴色素所需要的酶量为一个酶活力单位(式(3).实验重复 3 次,取均值.310,A VUt b=(3)式中:U 为酶活力,molmin-1;A为吸光值变化量;V 为反应体系溶液总体积,mL;t 为反应时间,min;为多巴色素摩尔吸光系数,L(molcm)-1;b为比色皿厚度,cm.1.5 生物催化合成生物催化合成 L-多巴多巴 L-酪氨酸在 TYR 催化作用下转化为 L-多巴,而 L-多巴不稳定,易被进一步氧化为多巴醌,所以为了得到产物 L-多巴,需向反应体系中添加 L-抗坏血酸(图 3).为探究影响合成反应产物 L-多巴的诸多单因素(反应时间、反应温度、溶液 pH 值、L-抗坏血酸浓度),称取 10mg固定化酶,加入含有L-酪氨酸(2mmolL-1)的不同pH值磷酸缓冲液配置的10 mL底液,反应体系在恒温震荡培养箱中反应.反应体系的 pH 值通过缓冲溶液调节,温度通过设置培养箱调节.利用控制变量法,逐一改变反应时间、pH 值、温度、L-抗坏血酸浓度,得出最优合 图 2 固定化 TYR 及催化合成 L-多巴示意图 等电点=5.92 pH=6.5 ZnO 纳 米 线 L-酪氨酸 HO COOH NH2 HO HO COOH NH2 等电点=9.50 L-多巴 O2 36 宁波大学学报（理工版）2023 成 L-多巴条件.L-多巴产率(Y)的计算公式为:DT/100,YCC=%(4)式中:CD为反应结束 L-多巴浓度,mmolL-1;CT为反应加入的 L-酪氨酸浓度,mmolL-1.1.6 HPLC 检测分析检测分析 将待测液经 0.22m 滤膜过滤,利用高效液相色谱仪(SPD-10A 检测器和 LC-10AT 泵,岛