泌淋清胶囊对不同白血病细胞株增殖及凋亡的影响_秦川霞.pdf

基础研究泌淋清胶囊对不同白血病细胞株增殖及凋亡的影响秦川霞，黎中恒，黄磊，饶青，宋晶睿，黄裕兵，李艳梅（省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室 贵州医科大学 基础医学院 免疫教研室，贵州 贵阳；贵阳市公共卫生救治中心 感染二科，贵州 贵阳）摘 要目的 探讨泌淋清胶囊（）对不同白血病细胞株增殖及凋亡的影响。方法 取适量，采用醇提旋蒸冻干方法配制成 母液备用；取对数生长期人红白血病细胞株 分为、及 组及对照组，取对数生长期人慢性髓系白血病细胞 分为.、.、.及.组及对照组，取对数生长期的人急性淋巴细胞白血病细胞 分为.、.及.组及对照组，种细胞均培养不同时间及多个时间点、采用噻唑蓝比色法（）测定各组细胞的存活率；取对数生长期 细胞，设置、及 及对照组（浓度等量的溶剂），分别培养 和 ，采用流式细胞仪检测 细胞 和 的细胞凋亡率。结果 各浓度 组于 时，细胞株、的存活率均随 浓度的增加而降低（.），各浓度 组 细胞的存活率随 浓度的增加而降低、细胞活力随时间的延长而下降（.或 .或 .）；各浓度 组 细胞的凋亡率随着 浓度的增加而增高（.）。结论 可抑制不同类型白血病细胞（、及）增殖，促进 细胞凋亡。关键词白血病；细胞；细胞；增殖；凋亡；泌淋清胶囊；细胞中图分类号；文献标识码 文章编号（）：，（，；，），（），第 卷 第 期 年 月 贵 州 医 科 大 学 学 报 基金项目国家自然科学基金（）；贵州省自然科学基金项目（黔科合平台人才，黔科合支撑，黔科合基础 一般，黔科合基础 一般）贵州医科大学 级硕士研究生通信作者：引用本文：秦川霞，黎中恒，黄磊，等 泌淋清胶囊对不同白血病细胞株增殖及凋亡的影响 贵州医科大学学报，（）：，（），（）（）（）（，）；白血病是一类造血干祖细胞的恶性克隆性疾病，因白血病细胞自我更新增强、增殖失控、分化障碍及凋亡受阻，而停滞在细胞发育的不同阶段，在骨髓和其他造血组织中白血病细胞大量增生累积，使正常造血受抑制并浸润其他器官和组织。据 年全球癌症统计报告，世界上每年至少有 万人因白血病死亡。在恶性肿瘤所致的死亡率中，我国白血病居第 位，每年约 万余人因白血病而死亡，在儿童及 岁以下成人中居第 位。目前白血病的治疗方法包括化疗、靶向治疗、免疫治疗及异基因造血干细胞移植等，但是治疗结果不容乐观，耐药、复发率高、副作用多、寻找供者难及费用高等，迫切需要更有效、毒副作用小及药物来源不受限的治疗药物。近年来，中药被有效地用于治疗实体肿瘤，植物很可能是抗癌药物的来源之一，越来越多的研究证明了中药对癌症患者的疗效。贵州是中药资源大省，现有中药材品种资源 种，占全国中药材种类总数的，居全国第 位。据文献调研表明，国内外仅有少量的文献报道贵州民族药抗白血病活性的研究。本研究旨在贵州民族药中寻找来源广泛、毒副作用小的抗白血病的天然药物。泌淋清胶囊（，）是一种贵州民族药，中医认为其清热解毒、利尿通淋，用于湿热蕴结所致的小便不利，淋漓涩痛，尿血，急性非特异性尿路感染，前列腺炎见上述证候者。主要成份包括四季红、黄柏、酢浆草、仙鹤草、白茅根及车前草 味中药材，其中黄柏、车前草为贵州地道药材。黄连素（，）属于异喹啉类生物碱，可从黄连和黄柏中提取，用于治疗癌症、消化、代谢、心血管及神经系统疾病；车前草有降血脂、肝损伤保护、抗氧化、抗炎、降尿酸及造血等作用，但该药功能主治中无治疗白血病范畴，因此，本研究通过（，二甲基噻唑），二苯基四氮唑溴盐（，），法、流式细胞仪测定 对不同白血病细胞株增殖及凋亡的影响。材料与方法.实验材料.细胞来源人红白血病细胞、人慢性髓系白血病细胞 及人急性淋巴细胞白血病细胞株 均来自贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室液氮冻存。.主要药物及试剂（医联健康平台），培养基（美国），胎牛血清（，；浙江天杭生物），、二甲基亚砜（，；北京索莱宝），细胞凋亡试剂盒（美国）。.主要仪器 多功能酶标仪（美国），流式细胞分析仪（美国艾森），型生物安全柜、离心机、细胞培养箱、超低温冰箱（美国），倒置荧光显微镜（德国 ），电子天平（美国），立式压力蒸汽灭菌器（上海申安）。.实验方法.细胞培养从液氮罐取出、及 细胞复苏，用含 胎牛血清的 培养液，的 恒温培养箱中培养至对数增长期。.样品的制备 按需称取适量 药物（去除胶囊壳），按料液比 溶于 乙醇溶液（另 为）中，充分混匀，摇床摇 期秦川霞等 泌淋清胶囊对不同白血病细胞株增殖及凋亡的影响，超声 ，脱脂棉过滤 次；旋蒸仪旋蒸去除乙醇，过夜；冻干机去除水分，得粉末状样品；称量所得粉末状样品，将其配成 的 母液（溶剂为 溶液，另 为）备用。.配制 溶液 称取 粉末.，加灭菌磷酸盐缓冲液（，），配成 的 溶液，溶解，.过滤膜过滤除菌，分装，保存，备用。.配制三联液称取十二烷基硫酸钠（，），加少于 的 使其充分溶解，加异丙醇 后定容至，加盐酸 。.细胞的 法测定取对数增长期的 细胞（接种密度为 个 孔）接种于孔板中，每孔 培养基（含 ），培养，每孔加不同浓度的 ，使其终浓度分别为、及 ，每个浓度设 个复孔（记为实验组）和 个实验空白孔（实验空白孔仅有培养基和对应浓度的药物，未接种 细胞）；另设对照组（加 溶液 ），对照组设置 个复孔和 个对照空白孔（对照空白孔仅有培养基和 溶液，未接种 细胞）。细胞置于 培养箱内开始计时，培养；每孔加 溶液 ，培养 ；每孔加三联液 ，培养箱过夜；酶标仪测 波长各孔的吸光度（，），计算存活率。.细胞的 法取对数生长期的 细胞（接种密度为 个 孔）接种于 孔板中，每孔 培养基（含 ），培养，每孔加不同浓度的 ，使其终浓度分别为.、.、.及.，每个浓度设 个复孔（记为实验组）和 个实验空白孔（实验空白孔仅有培养基和对应浓度的药物，未接种 细胞）；另设对照组（加 溶液 ），对照组设置 个复孔和 个对照空白孔（对照空白孔仅有培养基和 溶液 ，未接种 细胞）。细胞置于 培养箱，培养；每孔加 溶液，培养，每孔加三联液（、异丙醇 及盐酸，加 至终体积为 ），培养箱过夜；酶标仪测 波长各孔的，计算存活率。.细胞的 法 取对数生长期的人白血病细胞（接种密度为 个 孔）接种于 个 孔板中，每个 孔板进行如下处理：每孔加 培养基（含 ），培养；加不同浓度 ，使其终浓度分别为.、.及.，每个浓度设 个复孔（记为实验组）和 个实验空白孔（实验空白孔仅有培养基和对应浓度的药物，未接种 细胞）；另设对照组（加 溶液 ），对照组设置 个复孔和 个对照空白孔（对照空白孔仅有培养基和 溶液 ，未接种 细胞）。细胞置于 培养箱，个 孔板分别培养、及 ，于不同时间点的 孔板内每孔加 溶液 ，培养 ，每孔加三联液（、异丙醇 及盐酸 混合，加 至终体积为 ），培养箱过夜；酶标仪测 波长各孔的，计算存活率。.流式细胞仪测定 取对数生长期的人白血病细胞 以 个 皿的接种密度接种于 的圆形培养皿，每个培养皿加 培养基（含 ），细胞培养箱中培养，加不同浓度的，终浓度分别为、及 ；对照组加与 浓度等量的溶剂（溶液），于 的 培养箱中培养，分别收集 和 的细胞，用碘化丙啶（，）、染色，于流式细胞仪上测细胞凋亡并计算细胞凋亡率。.统计学分析各实验均重复 次以上，使用 .软件进行数据处理；正态分布计量资料以均数 标准差（）表示，个样本均数比较采用两独立样本 检验进行数据分析，多个样本均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用 检验；.为差异有统计学意义。结果.细胞存活率由图 可见，、及 作用于人红白血病细胞 ，随着 浓度的增加，细胞存活率越低；与对照组相比，及 组人红白血病细胞 存活率均明显降低，差异有高度统计学意义（.）。贵 州 医 科 大 学 学 报 卷注：（）与对照组比较，.。图 各浓度 组人红白血病细胞 的存活率 .细胞存活率由图 可见，.、.、.及.作用于人慢性髓系白血病细胞 细胞，随着 浓度的增加，细胞的存活率越低；与对照组相比，.、.及.组 细胞存活率均明显降低，差异具有高度统计学意义（.）。注：（）与对照组比较，.。图 各浓度 组人慢性髓系白血病细胞 的存活率 .细胞存活率由图 可见，.、.及.作用于人急性淋巴细胞白血病 细胞 ，随着 浓度的增加，细胞的存活率越低；与对照组相比，.组 细胞存活率降低，差异具有统计学意义（.）；.及.组 细胞存活率均明显降低，差异具有高度统计学意义（.）。.流式细胞术检测 细胞凋亡率由图 可见，、及 作用注：与对照组比较，（）.，（）.。图 各浓度 组人急性淋巴细胞性白血病细胞 的存活率 于人急性淋巴细胞性白血病细胞 ，随着 浓度的增加，细胞的凋亡率越高；与对照组相比，及 组 细胞凋亡率均明显增高，差异有高度统计学意义（.）；、及 作用于人急性淋巴细胞性白血病细胞 ，随着 浓度的增加，细胞的凋亡率越高；与对照组相比，及 组 细胞凋亡率均明显增高，差异有高度统计学意义（.），且与对照组相比，比 的差异更明显。讨论白血病临床表现与正常造血细胞生存受抑和白血病细胞增殖浸润有关；正常造血细胞生成受抑可引起感染、发热、出血和贫血；白血病细胞增殖浸润可导致肝、脾、淋巴结肿大及其他器官病变；症状的缓急主要取决于白血病细胞在体内的增长速率和积蓄程度。白血病细胞通过对细胞凋亡的抵抗保持无限增殖，这些细胞可积聚在外周血、骨髓和淋巴器官中。目前白血病的治疗结果并不容乐观。随着医药学的发展，天然药物在抑制肿瘤生长、增加化疗药物疗效或减轻化疗药物毒副反应方面的优势越来越受到研究者的重视。中药（复方）由多个单方、多种化学成分组成，具有多成分、多效应、多靶点及多途径的特征。随着中草 期秦川霞等 泌淋清胶囊对不同白血病细胞株增殖及凋亡的影响注：为凋亡率流式图（作用于 细胞 和 ），为凋亡率线图；（）与同时间点对照组比较，.。图 各浓度 组 细胞 和 的细胞凋亡 药研究的发展，大量研究表明，中草药与化疗药物联合应用，可提高化疗药物的疗效。中药的现代化研究是科学发展的必然过程。贵州省有中草药资源 种，其中药用植物 种，被列入国家重点保护的药用植物有 种，占全国 种的.。贵州省中药材资源丰富、气候适宜、生态优良、民族医药积累丰富。贵州民族药用于肿瘤辅助治疗已广泛应用于临床，且临床效果已得到充分肯定。所以，本研究旨在从贵州民族药中寻找一种能抗白血病的天然药物。本研究首先对民族药进行了醇提旋蒸冻干的处理，通过 法对 种不同类型的白血病细胞模型进行了细胞增殖的研究，结果表明 对人红白血病细胞、人慢性髓系白血病细胞 以及人急性淋巴细胞白血病细胞 的生长繁殖有显著的抑制作用，且随着 浓度的增加，种细胞的存活率均明显下降；结果显示，与对照组相比，分别作用于 种细胞 ，.、.组 细胞及.组 细胞的增殖均受到明显的抑制（.）；、细胞代表了白血病的 种不同分型，在体外对这 种白血病细胞均有显著的抑制增殖的作用；由流式细胞术结果可以看出，无论是 还是，与对照组相比，及 组 细胞发生凋亡，差异更明显（.）。是已上市的贵州民族贵 州 医 科 大 学 学 报 卷药，可直接应用于人体，且原材料丰富、来源不受限，因此具有很好的临床应用前景；本研究探讨了 的新用途和新功效，其很可能成为抗白血病的新药，或从其中分离出能高效增敏的化合物。但是，目前对于 抗白血病的机制还不够明确，本研究团队将对其作用机制进行系统、深入的探究。综上所述，贵州民族药 可以有效抑制不同类型白血病细胞的增殖并促进凋亡，尤其是对人红白血病细胞、人慢性髓系白血病细胞 以及人急性淋巴细胞白血病细胞，具有制备白血病细胞增殖抑制剂或防治白血病药物的潜在价值。参考文献 陈灏珠，林果为，王吉耀 实用内科学 版 北京：人民卫生出版社，：，：，（）：，（）：葛均波，徐永健 内科学 版 北京：人民卫生出版社，：，：（），（）：，：王璐，孙兴，卢博礼，等 贵州省中药民族药产业发展现状和展望 安徽农业科学，（）：杨桦 苗药“见血飞”治疗白血病临床观察 中国民族民间医药，：杨桦 苗药“九根杉参”治疗白血病 例临床分析中国民族民间医药，：周斌，王元辉，舒娟 泌淋清胶囊的定性及定量分析 中国