尿激酶在治疗慢性创面中的作用_刘太阳.pdf

宁夏医科大学学报45卷由于各种原因造成的创面经过 13 个月的正规治疗没有愈合趋势，进入病理性炎性反应状态，临床上称为慢性创面1-2。慢性创面具有病程长、治疗难度大、易复发、费用昂贵等特点，给患者身体和心理带来巨大痛苦3。因此，探索更加廉价、方便、有效的治疗方案对于慢性创面治疗有十分重要的意义。创面局部血管受损后血栓形成，影响创面局部血液循环和营养供应。有专家提出“创面床准备”的概念4，旨在改善局部血液循环，增加促进创面愈合的物质5，改善创面的局部“微环境”，使慢性创面变为对治疗有反应的创面6。尿激酶是一种纤溶酶原激活剂，能直接作用于内源性纤维蛋白溶解系统，降解纤维蛋白原及纤维蛋白凝块，溶解血栓7。尿激酶能溶解腹腔内纤维隔、纤维蛋白以及引流管中的菌膜，治疗腹膜炎8-9。应用尿激酶可溶解胸腔内的纤维蛋白及纤维蛋白原，裂解纤维分隔，防止胸膜粘连，稀释胸腔积液，促进胸腔积液的吸收及引流10。而且，尿激酶在体外对于中心静脉导管和透析导管中的血栓或纤维条索也能发挥其纤溶作用11。目前，尿激酶在慢性创面中应用是否有效并示确证。因此，本研究将探讨尿激酶在慢性创面床准备中的效果以及临床应用的安全性。1对象与方法1.1研究对象1.1.1一般情况回顾性分析 2019 年 6 月至2021 年 4 月重庆大学附属涪陵医院烧伤整形科诊断的慢性创面的 52 例患者。其中生理盐水组27 例，女性 9 例，男性 18 例；尿激酶组 25 例，女性 8 例，男性 17 例。年龄 2380 岁，创面面积2356 cm2。本研究经过重庆大学附属涪陵医院伦理委员会批准（2019CQSFLZXYYEC-019）。1.1.2纳入标准1）20 岁年龄80 岁，男女尿激酶在治疗慢性创面中的作用刘太阳，余恩艳，陈志勇，余雪丰，赵涛（重庆大学附属涪陵医院，涪陵408000）摘要：目的观察尿激酶在慢性创面中的疗效及临床应用的可行性。方法本研究选取 2019 年 6 月至 2021年 4 月重庆大学附属涪陵医院烧伤整形科 52 例慢性创面患者为研究对象。患者分为生理盐水组（n=27，0.9%生理盐水）和尿激酶组（n=25，尿激酶 5 000 IU mL-1），收集创面分泌物检测白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis facfor-，TNF-）含量，并进行肉芽组织和渗液评分。治疗结束后，行 HE 染色和 Masson 染色评价肉芽组织血管生成、胶原含量和排列情况，免疫组化分析血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、转化生长因子 （transforming growth factor，TGF-）的表达情况，Westernblot 和 RT-qPCR 检测创面肉芽组织型胶原（Collagen）、平滑肌肌动蛋白（smooth muscle actin，-SMA）的表达情况。结果52 例患者治疗后无严重并发症。尿激酶治疗后，尿激酶组创面分泌物的 IL-6、TNF-含量均低于生理盐水组（P 均0.05）。尿激酶组创面肉芽组织改善情况优于生理盐水组（P0.05）。创面肉芽组织 HE 染色结果显示，尿激酶组创面肉芽组织新生血管数量高于生理盐水组（P0.05）。Masson 染色可见，尿激酶组创面肉芽组织中胶原蛋白排列较整齐，而生理盐水组胶原蛋白排列紊乱。尿激酶组胶原蛋白含量高于生理盐水组（P0.05）。免疫组化结果提示，尿激酶组创面肉芽组织中 VEGF、TGF-含量均高于生理盐水组（P 均0.05）。Western blot 和 RT-qPCR 结果提示，尿激酶组 Collagen I、-SMA 表达增强（P 均0.05）。结论尿激酶可以降低慢性创面的炎性反应，增加肉芽组织中新生血管数量和胶原含量，提高 VEGF、TGF-、Collagen I 和-SMA 的含量，改善创面情况，使用安全、疗效可靠，便于临床推广应用。关键词：尿激酶；慢性创面；创面愈合；细胞因子中图分类号：R641文献标识码：ADOI：10.16050/ki.issn1674-6309.2023.03.010文章编号：1674-6309（2023）03-0282-08论著收稿日期：2022-08-20基金项目：重庆市科卫联合医学科研项目（2019QNXM045）作者简介：刘太阳（1989），男，博士，研究方向：创面修复。E-mail：通信作者：赵涛，男，主任医师，研究方向：创面修复。E-mail：第 45 卷3 期2023 年 3 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University2823期刘太阳，等.尿激酶在治疗慢性创面中的作用不限；2）符合慢性创面诊断标准；3）创面面积2356 cm2；4）无 HIV 感染；5）凝血功能正常、外周血细胞和血小板无明显减少；6）无严重全身感染、恶病质、肾功能不全等；7）签署知情同意书并愿意参与本研究。1.1.3排除标准1）糖尿病酮症酸中毒患者；2）急危重症患者，一般情况差不能耐受者；3）对研究用药及成分过敏者；4）癌性创面者；5）中途退出或失访，临床资料不全者。1.2主要材料与试剂注射用尿激酶（武汉人福药业有限责任公司），0.9%氯化钠注射液（四川科伦药业股份有限公司），肿瘤坏死因子-（tumor necrosis factor-，TNF-）测定试剂盒（美国西门子公司），白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）测定试剂盒（美国西门子公司），苏木素染液（武汉赛维尔生物科技有限公司），伊红染液（武汉赛维尔生物科技有限公司），Masson 染色试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司），免疫组化试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司），RNA simple Total RNA Kit 天根生化科技（北京）有限公司，全蛋白提取试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），TB Green Premix ExTaq（美国 TaKaRa 公司），型胶原（Collagen）抗体、-平滑肌肌动蛋白（smooth muscleactin，-SMA）抗体、-actin抗体（美国Affinity 公司）。1.3主要仪器设备酶标仪（重庆博腾制药科技股份有限公司），超微量分光光度计（美国通用公司），化学发光成像系统（美国伯乐公司），荧光定量 PCR 仪（德国耶拿分析仪器股份公司），数字切片扫描与应用系统（麦克奥迪实业集团公司）。1.4实验方法1.4.1换药及渗液收集方法尿激酶组和对照组连续换药 4 d，每次予碘伏常规消毒，生理盐水清洗创面。对照组予 0.9%生理盐水外敷创面，实验组予 5 000 IU mL1浓度尿激酶外敷创面。两组均使用海藻酸盐敷料为浸润伤口的载体，换药时敷料均完整覆盖创面，外用无菌纱布包扎。连续用药 4 d，每 24 h 收集创面分泌物检测 IL-6、TNF-含量。1.4.2创面分泌物 IL-6、TNF-的检测方法将装 有 IL-6、TNF-的 试 剂 和 试 剂 放 入 IM MULITE1000 化学发光免疫分析仪。将样品杯托架放在样本链上，将上述收集好的上清液500 L 放入样品杯中。然后将样本杯放在托架上，接着放入 5 个测试杯。免疫分析仪自动检测各指标。1.4.3创面肉芽组织评分及创面渗液评分11采用 Likert 4 级评分法对实验前后创面肉芽组织及渗液按 03 分进行评分，评分越高创面条件越差，见表 1。表 1慢性创面的肉芽组织及渗液评分标准0 分1 分2 分3 分肉芽组织评分肉芽生长良好，鲜红，质实肉芽良好，淡红，不齐，呈颗粒状生长肉芽较差，色白，炎性渗出多基本无肉芽，色暗，创面渗液、糜烂、坏死渗液评分无明显渗液或渗液不能渗透 1 层纱布创面有少量渗液，渗透12 层纱布创面有较多渗液，渗透34 层纱布创面有大量渗液，渗透 4层以上纱布类别1.4.4HE 染色常规石蜡切片脱蜡至水，放入苏木素染液中染色 5 min，自来水冲洗掉多余染液。放入 1%盐酸乙醇中浸泡分化 3 s，自来水冲洗 1 min，水洗蓝化 30 min。放入伊红染液中染色，常规脱水，干片后用中性树胶封片处理。1.4.5Masson 染 色石 蜡 切 片 脱 蜡 至 水，Weigert 铁苏木素染色。1%盐酸乙醇浸泡分化 3 s，丽春红酸性品红染料染色，再以苯胺蓝染料溶液中染色。常规脱水，干片后用中性树胶封片处理。1.4.6免疫组化石蜡切片脱蜡至水后进行抗原修复，滴加 10%山羊血清封闭，37 温箱封30 min。滴加稀释好的对应指标的一抗，孵育过夜。二抗孵育后 DAB 显色，复染封片后扫描分析。1.4.7Western blot准确称取创面组织 50 mg，加入蛋白质裂解液 lysis buffer 1 mL，玻璃匀浆仪匀浆，按说明书提取蛋白。用 BCA 蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。取适量 5loading buffer 混匀，100，5 min 煮沸变性，用 SDS-PAGE 电泳，浓缩胶（恒压 80 V），分离胶（恒压 120 V）；然后湿式转入 PVDF 膜中，5%脱脂奶粉封闭液封闭 2 h，敷一抗 4 过夜，洗膜后加入相应二抗，孵育 2 h，PBS 洗 5 次。用化学发光法检测蛋白条带，计算283宁夏医科大学学报45卷目标蛋白条带灰度与内参照（-actin）条带灰度之间的比值，即代表目标蛋白的相对含量。1.4.8RT-qPCR常规提取 RNA 后，逆转录成cDNA。按 RT-qPCR 反应体系操作，Collagen引物：F 为 5-GAGGGCCAAGACGAAGACATC-3，R 为 5-CAGATCACGTCATCGCACAAC-3。-SMA：F 为 5-AAAAGACAGCTACGTGGGTGA-3，R 为 5-AAAAGACAGCTACGTGGGTGA-3。PCR循环反应条件如下：30 s 变性（95），5 s 退火（95 ），30 s 延伸（60 ），40 个循环。采用 2-Ct法计算目的基因的相对表达水平。1.5统计学方法应用 SPSS 24.0 统计学软件进行数据分析，计数资料组间比较采用卡方检验，计量资料以均数标准差（xs）表示，两组间比较用独立样本 t 检验。检验水准=0.05。2结果2.1临床资料及尿激酶在慢性创面中应用的安全性52 例患者检测血小板计数、凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间及纤维蛋白原，均未见异常，两组患者年龄、性别比较差异均无统计学意义（P 均0.05），见表 1。表 1两组患者一般资料指标生理盐水组（n=27）尿激酶组（n=25）合计（n=52）t/2值P 值年龄（xs）/岁57.0713.7855.6815.3556.4014.431.480.22性别（女/男）/例9/188/1717/350.010.91血小板/（109/L）212.6738.55209.3247.26212.3843.230.890.34凝血酶原时间（xs）/s10.570.8810.690.7610.630.811.240.26活化部分凝血酶时间（xs）/s23.071.4622.321.5922.751.570.220.63凝血酶时间（xs）/s17.140.9516.410.9516.791.010.140.70纤维蛋白原（xs）/（g L-1）2.720.532.810.572.780.560.240.622.2尿激酶缓解了慢性创面炎症反应与生理盐水组相比，尿激酶组治疗后创面渗液未见明显减少。治疗后第 3、4 天，尿激酶组创面渗液的 IL-6 含量少于生理盐水组（P0.05）治疗后第 4 天尿激酶组创面渗液的 TNF-含量少于生理盐水组（P0.05），见表 2表 4。表 2两组患者各时间点创面渗液评分比较（xs，分）组别生理盐水组2.300.78尿激酶组2.120.734 d2.480.642.480.711 dn2725与生理盐水组比较*P0.05。表 4两组患者各时间点创面渗液中 TNF-的含量比较（xs