牡蛎热休克蛋白70吸附人源诺如病毒功能域的解析_王艳飞.pdf

病 毒 学 报CHINESE JOURNAL OF VIROLOGYVol.39No.2March 2023第 39 卷 第 2 期 2 0 2 3 年 3 月牡蛎热休克蛋白 70 吸附人源诺如病毒功能域的解析王艳飞1，张子蕾2，罗广达1，李静雯1，王大鹏1*（1.上海交通大学 农业与生物学院 食品科学与工程系，上海 200240；2.上海海关学院 检验检疫技术交流部，上海 200120）摘要：人源诺如病毒（Human norovirus，HuNoV）是全球范围内最重要的食源性病毒之一，牡蛎是其主要的食源性传播载体。已有研究发现：牡蛎热休克蛋白 70（oyster Heat shock protein 70，oHSP70）可吸附不同基因型 HuNoV，但 oHSP70吸附病毒的功能域不清楚。本研究对 oHSP70的 N 端和 C 端分别进行克隆表达纯化，并采用 ELISA 方法测定其与不同基因型 HuNoV 主要衣壳蛋白 P功能域的结合能力。实验结果表明：成功获得 N 端和 C 端 oHSP70的原核表达产物；N 端 oHSP70 与不同基因型 HuNoV P 蛋白结合能力显著强于 C 端（P0.05）。因此，N 端oHSP70是结合 HuNoV P 蛋白的主要结构域。本研究结果为进一步揭示 oHSP70与 HuNoV 互作的分子机制提供了理论支撑。关键词：人源诺如病毒；牡蛎；热休克蛋白 70；配体；原核表达中图分类号：Q939.99 文献标识码：A 文章编号：10008721（2023）02039308DOI：10.13242/ki.bingduxuebao.004280人源诺如病毒（Human norovirus，HuNoV）隶属于杯状病毒科（Caliciviridae）诺如病毒属，病毒粒子 直 径 27 40 nm，呈 二 十 面 体 对 称，无 包 膜。HuNoV 是单股正链 RNA 病 毒，基 因 组 全 长约7.5 kb，由 3 个开放阅读框（Open Reading Frames，ORFs）组 成13。ORF2 编 码 了 主 要 衣 壳 蛋 白（Major capsid protein，VP1），包 括 壳 区（Shell domain，S 区）和突出区（Protruding domain，P 区）；其中，P区具有病毒受体/配体识别的功能4，5。全球每年由 HuNoV 造成了 6.84 亿例感染，超600 亿美元经济损失；其中，食源性 HuNoV 污染导致高达 1.2亿人感染，3.5万人死亡6，7。在食品载体传播过程中，HuNoV 主要结合其吸附配体。为了有效防控 HuNoV，相关研究主要聚焦在 HuNoV 的受体和配体。其中，组织血型抗原（Histoblood group antigens，HBGAs）被 认 为 是 HuNoV 的（辅 助）受体8。生菜和牡蛎含有 HBGAs类似物，被认为是传播 HuNoV 的物质基础9。另外，本团队率先发掘并证实牡蛎热休克蛋白 70（Oyster heat shock protein 70，oHSP70）可结合 G.1 型和 G.4 型 HuNoV；且 oHSP70 对不同基因型病毒的结合能力存在差异，与 G.1基因型 HuNoV P 蛋白与结合能力强于G .4 型10，11。但 是，oHSP70 与 不 同 基 因 型HuNoV P蛋白结合的关键结合功能域尚不清楚。oHSP70 属于一类蛋白家族，具有高度序列同源性，结构高度保守，分为 N端和 C端两个较为独立的部分，具备分子伴侣、分子识别等生物学功能，已被广泛研究1214。本研究基于生物信息学预测了oHSP70 的 N 端和 C 端，并分别对 N 端和 C 端结构域进行了克隆、表达与纯化。同时，以不同基因型HuNoV的 P蛋白原核表达产物为对象，采用 ELISA评估 oHSP70 两个功能域（N 端和 C 端）与不同基因型 HuNoV P蛋白结合能力的差异，为后续进一步揭示 oHSP70 与不同基因型 HuNoV 互作的分子机制奠定理论基础。材料与方法1 菌株与质粒感受态细胞 E.coli DH5 与感受态细胞 E.coli BL21（DE3）购自于上海生工生物工程股份有限公司。原核表达质粒 pET28a 和重组质粒 pET28aoHSP70、pET28a1.1P、pET28a2.4P 均为实验室保存10。收稿日期：20220803；接受日期：20220922基金项目：国家自然基金面上项目（项目号：32072319），题目：牡蛎热休克蛋白 70与人源诺如病毒动态互作的分子机制作者简介：王艳飞（1998），男，从事人源诺如病毒吸附配体研究，Email：wang_通讯作者：王大鹏（1979），男，研究员，从事食源性病毒污染与控制研究，Email：开放科学（OSID）病 毒 学 报39卷2 主要试剂与设备Premix Taq 购于宝日医生物科技（北京）有限公司；限制性核酸内切酶购于赛默飞世尔科技，T4连接酶购于上海碧云天生物技术有限公司，DiaSpin柱式质粒 DNA 小量抽提试剂盒和 SDSPAGE 相关试剂、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠 IgG 购于上海生工生物工程股份有限公司；Ni NTA Beads 6FF 购 于 天 地 人 和 生 物 科 技 有 限 公 司，HuNoV P蛋白抗体由本实验室制备15。无菌超净工作台（SWCJ2FD）；小型垂直电泳槽（MiniPROTEAN Tetra Cell）；PCR 仪（T100 Thermal Cycler）；高 灵 敏 度 化 学 发 光 成 像 系 统（ChemiDoc XRS+System）；电脑恒流泵（DHLB）；电脑核酸蛋白检测仪（HD3000）。3 oHSP70的同源建模将 oHSP70 氨 基 酸 序 列 输 入 至 Discovery Studio，选取同源性较高的模板进行复合同源建模，所得模型以 PyMOL软件进行展示。4 oHSP70 N端与 C端的引物设计、扩增与双酶切oHSP70 编码基因全长 1 860 bp。根据生物信息学手段所分析 oHSP70 序列的结果，利用引物设计软件 Primer，设计出 N 端和 C 端的特异性引物并引入相应的酶切位点（表 1）。以重组质粒 pET28aoHSP70为模板，利用上述引物进行 PCR 扩增，获取 oHSP70 N 端和 C 端的核酸 片 段。PCR 反 应 体 系 为：2Premix Taq 10.0 L、模板 2.0 L、上下游引物各 1.0 L、ddH2O 6.0 L。PCR 反应程序为：95 C 变性 3 min，然后进入 35 次循环：95 C，30 s；55 C，30 s；72 C，1 min。最后 72 C 延伸 10 min。随后，将 PCR 产物回收后进 行 双 酶 切；双 酶 切 反 应 体 系 为 10FastDigest Green Buffer 2.0 L、Nco 1.0 L、Xho 1.0 L、目的 DNA 片段或质粒 16.0 L。酶切反应条件为37 C酶切 2 h。5 oHSP70 N端与 C端的连接与转化双酶切回收的目的 DNA 片段与 pET28a 质粒用 T4连 接 酶 进 行 连 接。连 接 产 物 分 别 命 名 为pET28aoHSP70N 和 pET28aoHSP70C；然后，将连接产物转化至 E.coli DH5感受态细胞，转化方法参考产品说明书。经菌落 PCR 和测序验证后提取质粒，并转化至 E.coli BL21（DE3）。6 oHSP70 及其 N 端与 C 端和 HuNoV P 的表达与纯化接 种 培 养 pET28a oHSP70 N/E.coli BL21（DE3）和 pET28aoHSP70C/E.coli BL21（DE3）重组菌。待菌液 OD600达到 0.6 左右时，加入终浓度0.4 mmol/L 的异丙基D硫代半乳糖苷，37 C、200 rpm 诱导培养 1216 h。取 1 mL 诱导菌液于1.5 mL 离心管中，12 000g 离心 2 min，用 1.0 mL PBS 洗涤收集的菌体，反复洗涤 2 次，加入 40.0 L PBS 重悬，加入 10.0 L 5蛋白上样缓冲液，混匀后煮沸 10 min，20 C 放置 2 min，12 000g 离心2min，小心吸取 10.0 L 上清加样进行 SDSPAGE检 测。SDSPAGE 电 泳 条 件 为：浓 缩 胶 80 V，20 min；分离胶 120 V，80 min。电泳结束后使用考马斯亮蓝 R250染色 30 min，清水脱色 12 h后使用照胶 仪 照 胶。采 用 Smart Lifesciences 的 Ni NTA Beads 6FF 填料进行蛋白纯化，使用含有不同浓度咪唑的洗脱液梯度洗脱目的蛋白。包涵体蛋白则采用 8 M 尿素变性，纯化完成后分别使用 6M、4M、2M、0M 尿素透析液梯度透析复性。将 pET28a 1.1P/E.coli BL21（DE3）和pET28a2.4P/E.coli BL21（DE3）活化培养，表达与纯化方法同上。7 oHSP70N 和 oHSP70C 与 P 蛋 白 结 合 能 力验证采用 BCA 蛋白测定试剂盒测定上述五种纯化蛋白的浓度。以 20.0 g/mL oHSP70 为阳性对照，依照 oHSP70N 和 oHSP70C 相对分子质量用包被表 1oHSP70 N端和 C端基因扩增引物序列及其插入的限制性核酸内切酶位点Table 1Primers for amplification of the Nterminal and Cterminal genes of oHSP70 and their inserted restriction endonuclease sitesGeneoHSP70NoHSP70CPrimerHSPNFHSPNRHSPCFHSPCREndonucleaseNco Xho Nco Xho Sequence（53）CACCCATGGCGGAGAAAAACCCGGTGCTCGAGCAGTTCGAGTTTGCCCACCCATGGGCAAACTCGAACTGGTGCTCGAGGCTTTCGCCGCGTTCLength1116bp759bp 3942期王艳飞，等.牡蛎热休克蛋白 70吸附人源诺如病毒功能域的解析缓冲液将其稀释至相同摩尔浓度，将 3 种样品加入酶标板包板作为底物，具体的 ELISA 步骤如下：向每个 ELISA 酶标孔中加入 100.0 L 样品，4 过夜包被；弃包被液，向每孔加入 150.0 L PBS 振荡 洗 涤 4 次。以 120.0 L/孔 加 入 1.0%BSA 于37 下封闭 2 h。弃封闭液后，向每孔加入 150.0 L PBS 振荡洗涤 4 次；分别向包被 3 种蛋白的ELISA 酶 标 孔 加 入 100.0 L/孔 的 不 同 基 因 型HuNoV P 蛋白，浓度为 10.0 g/mL，37 孵育 1 h。弃液后每孔加入 150.0 L TBST 洗涤 57次；分别向每孔加入 100.0 L 以 1 1 500稀释的 HuNoV P蛋白一抗，于 37 下孵育 1 h。弃液后使用 150.0 l TBST 洗涤 57 次；分别向每孔加入 100.0 L 以1：4000 稀释的 HRP 标记的 IgG，于 37 下孵育 30 min。弃液后使用 150.0 L TBST 洗涤 5次；向每孔加入 100.0 L TMB，避光条件下反应 10 min 后，加入 50.0 L 的 2 M H2SO4终止反应。随后读取在450 nm 波 长 下 的 吸 光 值；阴 性 对 照 孔 以 1.0%BSA进行包被，其余加液与各实验组相同。8 统计分析本 文 数 据 统 计 分 析 与 作 图 采 用 IBM SPSS Statistics 24 和 Graphpad Prism