内蒙古乌兰察布市马铃薯致病疫霉分离鉴定及特征分析_穆青慧.pdf

第 44 卷 第 1 期2023 年1 月Vol.44 No.1Jan.2023内蒙古乌兰察布市马铃薯致病疫霉分离鉴定及特征分析穆青慧，林睿，周娜，白薇*（内蒙古农业大学生命科学学院，呼和浩特 010011）摘要：内蒙古乌兰察布市是我国重要的马铃薯产地，为研究该地区的晚疫病病原菌发生情况及特性，在该地田间采集患病马铃薯叶片并分离纯化致病疫霉菌株，进行分子鉴定、交配型鉴定、生长特性分析、耐药性检测和毒力测定。结果显示，从该地6个区分离到15株菌株，分离得率为41.7%，且分离到的菌株以菌丝生长速率一般型为主，占比73.00%。多数菌株生长耐受温度范围在1024、26之间。该地以弱致病型性菌株占比最高，其次是一般型菌株。该地鉴定到13株A1交配型菌株，2株A2交配型菌株。针对精甲霜锰锌和银法利的耐药性，对精甲霜锰锌的高抗型菌株占比86.67%，对银法利的高抗型菌株占比60.00%，以高抗型菌株占比最高。分离到的菌株弱致病性菌株比例最高，占比达46.67%，强致病性菌株比例最少，占比20.00%。研究揭示了乌兰察布市致病疫霉的特征特性，为马铃薯晚疫病的防治提供了思路。关键词：马铃薯；致病疫霉；分离鉴定；特征分析中图分类号：Q939.92 文献标识码：A 文章编号：1009-3575（2023）01-0007-06Isolation，Identification and Characteristic Analysis of Phytophthora Infestans on Potatoes in Ulanqab，Inner MongoliaMU Qinghui，LIN Rui，ZHOU Na，BAI Wei*（College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010011，China）Abstract：Ulanqab is an important potato producing place in China.To study the occurrence and characteristics of late blight patho-gens in this area，diseased potato leaves were collected in the fields，and Phytophthora infestans strains were isolated and purified.The molecular and mating type identification，growth characteristics analysis，drug resistance detection，and pathogenicity test were conducted.The results showed that，15 strains were obtained from six regions，the isolating frequency were 41.7%.The strains iso-lated were mainly medium growth type of mycelial，accounting for 73.00%.The growth temperature range of most strains was be-tween 10 C and 24 C or 26 C.In this area，the weak pathogenic strains made up the highest proportion，followed by the general pathogenic strains.A total of 13 strains of A1 mating type，and 2 strains of A2 mating type，were identified.For the drug resistance to Metalaxyl mancozeb and Infinito，highly resistant strains were the majority.The highly resistant strains to Metalaxyl mancozeb ac-counted for 86.67%，and the highly resistant strains to Infinito accounted for 60.00%.Whereas，for the pathogenicity，the propor-tion of weak pathogenic strains was the highest，accounting for 46.67%，and that of strong pathogenic strains was the lowest，ac-counting for 20.00%.The research revealed the properties of Phytophthora infestans strains in Ulanqab，and provided ideas for the prevention and treatment of late blight on potato.Key words：Solanum tuberosum；Phytophthora infestans；Isolation and identification；Characteristic analysis马铃薯（Solanum tuberosum）是中国重要的主粮作物之一，也是世界广泛种植的农作物。马铃薯在世界范围内对缓解粮食危机、防范饥荒起到了重要作用，据中国统计局统计，近 10 a 单位亩产量增产仅次于小麦，2021年我国马铃薯产量已达3 043.54万t，马铃薯种植面积已达7 333.4 khm2（https：/da-）。尽管马铃薯产业发展迅速，然而马铃薯病害依旧严重制约了马铃薯产业的发展1。致病疫霉（Phytophthora infestans）属卵菌纲（Oomycetes）霜霉目（Peronosporales）腐霉科（Pythiaceae）疫霉属（Phy-tophthora）2，由致病疫霉引起的晚疫病是马铃薯最主要的真菌病害，晚疫病的发生导致植物茎叶坏死，从而造成光合作用下降，生物质积累减少，直接导致作物减产。19世纪40年代，爱尔兰晚疫病大流行，马铃薯减产1/3，并且持续了7 a之久，晚疫病引起的农业减产直接导致了爱尔兰人口锐减 20%左右3。致病疫霉属异宗配合卵菌，存在A1和A2两种交配型，田间以A1交配型为主。A2交配型最早在墨西哥发现，20世纪80年代后，迅速传播至全球几乎所有马铃薯生产国家4。20世纪90年代，中国首次报道了内蒙古、山西等地发现马铃薯晚疫病菌A2 交配型5。致病疫霉生活史包括有性阶段和无DOI：10.16853/ki.1009-3575.2023.01.002内 蒙 古 农 业 大 学 学 报（自 然 科 学 版）Journal of Inner Mongolia Agricultural University（Natural Science Edition）收稿日期：2022-10-03基金项目：国家自然科学基金项目“富含半胱氨酸类受体激酶StCRK1和StCRK2在马铃薯抗病防御反应中的功能研究”（32060613）作者简介：穆青慧（1996），女，硕士研究生，主要从事植物抗病分子生物学方面的研究；*为通信作者，白薇E-mail：2023 年内 蒙 古 农 业 大 学 学 报（自 然 科 学 版）性阶段，在无性繁殖阶段病原菌在易感宿主组织中快速繁殖并感染宿主，侵染植物主要发生在无性阶段。水中的孢子囊在高温（最佳温度约2025C）下通过胚芽管发芽，或在较低温度（最佳温度1015）下释放无壁游动孢子进一步扩大病情6。在有性阶段产生的卵孢子是越冬和抵御逆境的主要形式，不同交配型菌株间的有性生殖使得病原菌的遗传性状更易发生变异，从而产生更耐药及致病性更强的菌株，是防治晚疫病面临的主要难题7。内蒙古自治区是中国马铃薯主要的种植地区，内蒙古乌兰察布市被称为“中国马铃薯之都”，是内蒙古自治区马铃薯的重要产地，马铃薯种植区约占自治区农业种植总面积的1/3 1。晚疫病是该区马铃薯生产中的主要危害，因此，研究此地的致病疫霉的特征特性及其病原的交配型发生频率和耐药性水平高低，对指导马铃薯产业实践具有重要意义。1材料与方法1.1样品采集试验样品于 2020年 8月初采自内蒙古乌兰察布市，8月份降雨增多，夜间气温降低，低温高湿环境有利于致病疫霉的繁殖，是马铃薯晚疫病的高发期。在该地区设6个采样地点，每个地点采集6株患病植物，每个样本的间距尽量控制在10 m以上，采样36个，采样地如表1所示，样品在低温冰盒中保存，低温运送至实验室备用。1.2致病疫霉的分离纯化将采集的患病马铃薯叶片用无菌蒸馏水冲洗干净，放置在琼脂水培养基内，叶片下表面朝下，18黑暗培养2 d。为避免杂菌对分离致病疫霉菌株的影响，待培养基上有肉眼可见菌丝时，立即将菌丝转移至选择培养基上，18黑暗培养2 d。沿菌丝边缘挑取少量菌丝，重复以上步骤，待重复3次以后转移至黑麦培养基上进行单孢或单菌丝体分离纯化。1.3致病疫霉的分子鉴定利用SDS法提取致病疫霉DNA，用致病疫霉特异性引物PiF&PiR8（GACTTTGTGAGTGTCTAACA-TA&CAAGACGAGCGCACCTATCG）进行PCR扩增，PCR反应体系（20 L）：10 Buffer 2 L，dNTPs Mix 2 L，引物PiF和PiR各0.5 L，exTaq酶（5 U/L）0.2 L，DNA 模板 1 L，无菌去离子水 13.8 L。PCR 反应条件：94 5 min；94 30 s，60 30 s，72 50 s，30个循环；72 10 min。从上述鉴定出的致病疫霉菌株中随机挑选 4 株用真菌核糖体 rDNA 区通用引物 I t s 1&I t s 4（T C C G T A G G T G A A C C T-G C G G&TCCTCCGCTTATTGATATGC）进 行 PCR扩增，进一步进行验证。PCR反应体系（20 L）：10 Buffer 2 L，dNTPs Mix 2 L，引物Its1和Its4各0.5 L，exTaq酶（5 U/L）0.2 L，DNA模板1 L，无菌去离子水 13.8 L。PCR 反应条件：94 5 min；94 1 min，55 40 s，72 60 s，30个循环；72 10 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并测序进一步鉴定，将测序结果在NCBI中比对，一致性99%时确定致病疫霉菌株至菌种水平。1.4致病疫霉培养及孢子囊收集将致病疫霉菌饼接种在新鲜的黑麦培养基上，18，暗培养710 d（使疫霉菌扩散到整个培养基）。取5 mL 10预冷无菌水加在疫霉菌平板上，用涂布器涂匀后将菌丝体刮下，加5 mL 10预冷无菌水清洗收集，10，3 300 rpm离心10 min，重悬孢子囊，将孢子囊悬液在8静置30 min释放孢子。血球计数板下计数。1.5致病疫霉生理特性分析1.5.1菌丝体生长速率从长满 9 cm 平板的疫霉菌菌落边缘挑取 7 mm的菌丝块转移至新的黑麦琼脂培养基上，18培养5 d，测量菌落半径，求出对应菌株菌落半径平均值。公式计算菌丝生长速率：菌丝生长速率(mm/d)=菌落半径平均值培养天数 （1）将疫霉菌依据生长速率不同分为生长快速型（5 mm/d），一般型（3 mm/d，5 mm/d），生长缓慢型（3 mm/d）。1.5.2致病疫霉菌丝生长适应温度测定最低生长适应温度测定：从长满9 cm平板的疫霉菌菌落边缘挑取7 mm的菌丝块转移至新的黑麦琼脂培养基上，分别在 8、10、12、24、