尼罗罗非鱼跨膜Bax抑制剂..._6的克隆、表达及功能鉴定_巫祎琴.pdf

第 38 卷第 2 期大连海洋大学学报Vol38 No22 0 2 3 年 4 月JOUNAL OF DALIAN OCEAN UNIVESITYApr 2 0 2 3DOI:1016535/jcnkidlhyxb2022-191文章编号:2095-1388(2023)02-0275-09尼罗罗非鱼跨膜 Bax 抑制剂母体 6 基因Tmbim 6 的克隆、表达及功能鉴定巫祎琴，陈福暖，张志强，江栢坚，简纪常，黄瑜*(广东海洋大学 水产学院，广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室，广东 湛江 524088)摘要:为了解跨膜 Bax 抑制剂母体 6(transmembrane Bax inhibitor motif containing 6，TMBIM 6)在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)病原体感染中的作用，利用聚合酶链式反应(PC)对 Tmbim 6 基因进行克隆与鉴定，并采用实时荧光定量 PC(qPC)分析 Tmbim 6 在健康尼罗罗非鱼(体质量为 80100 g)的组织分布模式及无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、Poly I:C 模拟病毒刺激后的表达变化。结果表明:尼罗罗非鱼 Tmbim 6 开放阅读框为 714 bp，可编码 237 个氨基酸，包含 6 个跨膜结构域和 1 个 C-末端基序;亚细胞定位显示，尼罗罗非鱼 TMBIM 6 定位于细胞质，双荧光素酶报告基因系统检测发现，Tmbim 6 在 HEK-293T 细胞中过表达后极显著抑制 NF-B 通路(P0.01);qPC 分析显示，Tmbim 6 基因在所检测的组织中广泛分布，在肝脏和肌肉中的表达量最高;经无乳链球菌感染和 Poly I:C 刺激后，Tmbim 6 在肝脏、脾脏、头肾、脑和肠道中的表达水平均显著上调(P0.05)。研究表明，尼罗罗非鱼 TMBIM 6 参与了无乳链球菌感染和 Poly I:C 刺激后的细胞应激过程及免疫反应。关键词:尼罗罗非鱼;Tmbim 6;亚细胞定位;NF-B;基因表达中图分类号:S 917.4文献标志码:A细胞凋亡又称细胞程序性死亡，是在真核生物中进化的一种常见的生理过程，目的是去除多余的、受感染的或受损的细胞，以维持内环境动态平衡1，在细胞发育、衰老、伤口愈合和清除病原体等生理活动中起着关键作用2。研究者现已阐明了多种导致细胞凋亡的途径，如线粒体依赖(内部)、线粒体非依赖性(外部)和内质网(E)介导的途径3 等。跨膜 Bax 抑制剂母体 6(transmembrane Bax in-hibitor motif containing 6，TMBIM 6)，又称 Bax 抑制剂-1(Bax inhibitor-1，BI-1)，1994 年在成年大鼠睾丸的 cDNA 文库筛选时被首次发现，并命名为Tegt(testis enhanced gene expression)，随 后 于1998 年在酵母中被鉴定为是一种抗凋亡蛋白，可以抑制 Bax 的促凋亡作用4。TMBIM 6 主要定位在内质网膜和核外膜，含有 6 7 个跨膜结构域，主要功能是保护细胞免受内质网应激诱导的细胞凋亡5。内质网是细胞内钙离子的主要储存区，在蛋白质的合成和折叠过程中起着重要作用，内质网腔内错误折叠与未折叠蛋白聚集及钙离子平衡紊乱均可以引起内质网应激，激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UP)、内质网超负荷反应和 Caspase-12 介导的细胞凋亡途径。TMBIM 6 作为一种抗凋亡蛋白，其过表达可以通过抑制 Bax 的激活与易位、Caspase 的激活和降低细胞内钙水平等来保护内质网应激诱导的细胞凋亡6。研究发现，TMBIM 6 可以抑制 UP 途径中肌醇酶 1(in-ositol-requiring enzyme-1，IE1)的蛋白活性，阻止其下游 c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminalkinase，JNK)的激活，从而通过抑制 Caspase-12活性来阻止细胞凋亡7。TMBIM 6 还参与细胞内钙稳态8、活性氧簇(OS)调节9、细胞免疫反应10，以及细胞增殖、凋亡和分化11 等多种生理过程。Lisak 等10 研究发现，TMBIM 6 通过调节淋巴细胞内的钙稳态，在适应性免疫系统的功能中发挥重要作用，缺收稿日期:2022-06-14基金项目:国家自然科学基金(32002426，32073006);湛江市非资助科技攻关计划项目(2020B01169)作者简介:巫祎琴(1998)，女，硕士研究生。E-mail:1525287075 通信作者:黄瑜(1986)，男，博士，讲师。E-mail:huangyu 乏 TMBIM 6 功能的小鼠中，胞浆和内质网的钙离子水平升高，导致 T 细胞和 B 细胞功能出现障碍。此外，内质网应激与 NK-B 的激活有着直接而密切的联系，内质网应激后，活化的 IE1 通过肿瘤坏死因子受体相关因子-2(tumor necrosis factorreceptor-associated factors 2，TAF2)与 IKK 形成复合体，进一步激活 IB 的上游激酶 IKK，诱导 IKK的磷酸化，从而导致 IkB 降解和 NF-B 激活12。近年来，有关 TMBIM 6 和 TMBIM 6 类蛋白参与细胞发育及其对生物和非生物胁迫的研究相继报道13，但对 TMBIM 6 在鱼类病原性感染中的作用知之甚少。目前，已经鉴定出 Tmbim 6 的硬骨鱼类有斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)14、暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)15，以及甲壳类的克氏螯虾(Procambarus clarkii)16 和 贝 类 的 栉 孔 扇 贝(Chlamys farreri)17 等。Du 等16 使用 NAi 下调克氏螯虾 Tmbim 6 表达，结果显示，在克氏螯虾 TM-BIM 6 功能缺失后，对白斑综合征病毒感染后诱导的细胞死亡率显著增加。而在石斑鱼虹彩病毒感染斜带石斑鱼过程中，Tmbim 6 过表达则可以抑制病毒诱导的细胞死亡、Caspase-3 活性和病毒基因转录14。由此可见，TMBIM 6 是细胞凋亡的重要调节因子，在鱼类抵抗病原体感染过程中参与了机体对细胞凋亡的作用。尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)作为中国优质的水产养殖品种之一，为渔业经济带来了巨大的收益。近年来，以无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)为主的罗非鱼链球菌病及罗非鱼湖病毒病在国内外时有发生，给尼罗罗非鱼养殖业造成严重的经济损失18-19。本研究中，对尼罗罗非鱼Tmbim 6 进行克隆与鉴定，分析了该基因在健康鱼组织中的分布模式及细菌与病毒感染后的表达变化，研究了 TMBIM 6 的亚细胞定位及其对 NF-B通路的影响，以期为探究尼罗罗非鱼 TMBIM 6 的生物学功能及免疫调节功能提供科学参考。1材料与方法1.1材料1.1.1试验动物尼罗罗非鱼(体质量为 80 100 g)购于广东省湛江市某养殖场，于广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室暂养 30 d后用于正式试验，水温控制在(285)。本试验中涉及试验动物的所有操作均严格遵守广东海洋大学动物伦理委员会决议内容及广东省实验室动物管理条例相关要求执行。1.1.2细胞、载体和试剂HEK-293T、无乳链球菌菌株(ZQ0901)由广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室分离及保存;NA 提取试剂盒(TransZolUp Plus NA Kit)、cDNA 反转录试剂盒(Trans Script One-Step gDNA emoval and cDNASynthesis Super Mix)和实时荧光定量 PC 试剂盒(TransStartGreen qPC SuperMix)均购自北京全式金生物技术公司;DH5 感受态细胞、PC 引物均购自生工生物工程(上海)股份有限公司;2MagicTaq DNA 聚 合 酶、pMD-19T 载 体 均 购 自TaKaa 公司;青霉素-链霉素溶液(100)、pEG-FP-N1 和 pcDNA 3.1 载体均购自碧云天生物技术有限公司;T4 DNA Ligase、QuickCutTMEco、Quick-CutTMXho 、Opti-MEM 培 养 基、Bovine Serum、Trypsin-EDTA(0.05%)、LipofectamineTM3000 Trans-fection eagent 试 剂 盒、普 通 质 粒 提 取 试 剂 盒(Plasmid Miniprep Kit)和 PC 产物纯化试剂盒(Thermo ScientificTMGene JETTMGel Extraction Kit)均购自 Thermo 公司;去内毒素质粒提取试剂盒(E.Z.N.ATMEndo-Free Plasmid Mini Kit)购自Omega 公司;Poly I:C 购自 Sigma-Aldrich 公司。1.2方法1.2.1引物设计与合成根据 Tmbim 6 基因序列(GenBank No.XM_ 003457055.5)，利用 PrimerPremier 5.0 软件设计 Tmbim 6 基因的 PC 和 qPC引物(表 1)，以尼罗罗非鱼-actin 作为内参基因。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。表 1试验引物Tab.1PC primers used in experiment引物primer序列(5-3)sequence(5-3)长度/bplengthTmbim 6F:CCGGAATTCATGAACGTGTTTGACCGCAG:CCGCTCGAGCTTCTTCTCCTTCTTCTTGTCC714qTmbim 6F:AAGAGACTGGCTATCCTCGC:GCGGTCACAATGATACTCGG103-actinF:AGATGAAATCGCCGCACTGG:TCTGACCCATACCCACCATCA1421.2.2总 NA 提取及 Tmbim 6 开放阅读框克隆随机抽取 3 尾实验室暂养 1 个月的尼罗罗非鱼，取其头肾组织，使用 TransZol up 传统法进行 NA 提取，提取的总 NA 测定浓度后，按照反转录试剂盒合成 cDNA。以取得的 cDNA 为模板，以带Eco和 Xho 酶切位点的 Tmbim 6-F/Tmbim 6-引物对672大连海洋大学学报第 38 卷Tmbim 6 开放阅读框(open reading franme，OF)片段进行克隆，经核酸电泳检测后进行 PC 产物纯化回收。随后将纯化的 PC 产物连接至 pMD-19T 载体中，并将构建的重组质粒 pMD19T-Tmbim6 质粒转化至 DH5 感受态细胞中(冰上操作)，在 37 下振荡(150 r/min)培育1 h后，涂布于含 Amp+(氨苄西林)的 LB 平板上，培养 8 h 以上;挑取大小均匀的圆形单菌落进行菌落 PC 鉴定后，再挑选阳性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。1.2.3生物信息学分析对测序正确的 Tmbim 6序列进行分析，获得 TMBIM 6 氨基酸序列，并对其进行生物信息学分析，所用分析软件见表 2。表 2生物信息学分析软件Tab.2Software for bioinformatics analysis软件或数据库software ordatabase预测内容content predicted网址ULExPASy蛋白的理化性质分析https:/web.expasy.org/prot-param/Inter ProScan预测蛋白功能结构域http:/www.ebi.ac.uk/ToolsSoftBerry-Psite氨基酸基本功能位点分布http:/ 6.0构建系统进化树DNAMAN氨基酸序列的同源性比对Clustal W氨基酸序列1.2.4