哌啶甲苯磺酰脒通过靶向GP...基因调控人卵巢癌细胞铁死亡_刘思溢.pdf

第 41 卷第 3 期2023 年 6 月广东医科大学学报JOURNAL OF GUANGDONG MEDICAL UNIVERSITYVol.41 No.3Jun.2023266哌啶甲苯磺酰脒通过靶向GPX4 基因调控人卵巢癌细胞铁死亡刘思溢，侯鉴基，招冠钰，孙阳，刘义，吴斌华*（广东医科大学海洋医药研究院，广东湛江 524023）摘要：目的探讨哌啶甲苯磺酰脒（PMSA）对人卵巢癌细胞（SKOV3 细胞）活力的影响，及其诱导细胞发生铁死亡的潜在分子机制。方法SKOV3 细胞用不同浓度PMSA（0、2.5、5、10、20、40 mol/L）处理，分别用MTT、Annexin-V-FITC/PI 染色、流式细胞术、Western blot 检测细胞活力、死亡、活性氧（ROS）、铁死亡相关信号通路分子表达。结果PMSA 以浓度依赖性方式抑制SKOV3 细胞活性，增加细胞死亡及ROS 含量，减少GPX4 和p-Nrf2 表达（P0.01 或 0.05）。分子对接预测PMSA 与GPX4 蛋白直接结合。结论PMSA 通过靶向GPX4 诱导SKOV3 细胞铁死亡，从而发挥抗癌作用。关键词：卵巢癌；哌啶甲苯磺酰脒；铁死亡中图分类号：R 737 文献标志码：A 文章编号：2096-3610（2023）03-0266-064-methyl-N-(piperidin-1-ylmethylene)benzenesulfonamide regulates ferroptosis of human ovarian cancer cells through GPX4 geneLIU Si-yi,HOU Jian-ji,ZHAO Guan-yu,SUN Yang,LIU Yi,WU Bin-hua*(Marine Biomedical Research Institute,Guangdong Medical University,Zhanjiang 524023,China)Abstract:ObjectiveTo study the effect of 4-methyl-N-(piperidin-1-ylmethylene)benzenesulfonamide(PMSA)on activity and ferroptosis of human ovarian cancer cell line SKOV3.MethodsAfter treated with different concentrations(0,2.5,5,10,20,40 mol/L)of PMSA,viability,death,reactive oxygen species(ROS),and ferroptosis-related signaling molecules of SKOV3 cells were detected by MTT,Annexin V-FITC/PI staining,flow cytometry,and Western blot,respectively.ResultsPMSA dose-dependently inhibited the viability,increased the death and ROS content,and decreased the expression of GPX4 and phosphorylated Nrf2 in SKOV3 cells(P0.01 or 0.05).Moleculardocking results indicated that PMSA could directly bind to GPX4.Conclusion PMSA might play an anti-cancer role by GPX4-targeted induction of ferroptosis in SKOV3 cells.Key words:ovarian cancer;PMSA;ferroptosis卵巢癌是一种具有较高发病率和病死率的女性生殖系统癌症1。由于传统的治疗方法存在治疗周期长、副作用大等缺陷，近年来人们正在深入探究更新、更有效的治疗方式2。有研究显示，诱导肿瘤细胞发生铁死亡是治疗卵巢癌等癌症的有效手段3-4。铁死亡是一种由脂质过氧化引起的铁依赖性细胞死亡，它在抑制肿瘤生长中具有重要作用5-6，因此开发出一种可以靶向细胞铁死亡并具有抗癌作用的药物对治疗卵巢癌具有重要意义7-9。脒类化合物及其衍生物被广泛应用于生物活性药物设计中，具有抗癌、抗真菌等重要作用10-11。不过目前有关脒类化合物对卵巢癌细胞生长的影响及收稿日期：2022-12-01基金项目：广东省科技计划项目（2019B090905011），湛江市科技研究计划项目（2020B01027、2021B01031），湛江市科技发展专项资金竞争性分配项目（2021A05050），广东医科大学大学生创新实验项目（ZYZF007）作者简介：刘思溢（1997-），女，在读硕士研究生，E-mail:wenny_通信作者：吴斌华（1974-），男，博士，讲师，E-mail:其相关分子机制尚未完全阐明。因此，在本研究中，我们通过实验室合成哌啶甲苯磺酰脒（PMSA）12，探究其对卵巢癌细胞SKOV3 活力的影响，初步分析其诱导细胞发生铁死亡的潜在分子机制，以期为开发和利用磺酰脒类分子药物提供新的思路，从而为卵巢癌的治疗提供更多的依据。1材料和方法1.1仪器与试剂流式细胞仪（Cytek，美国），细胞培养箱（Thermo，美国），酶标仪（Epoch，美国），DMEM 培养基（Gobico，第3 期刘思溢，等.哌啶甲苯磺酰脒通过靶向 GPX4 基因调控人卵巢癌细胞铁死亡267美国），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，Gobico，美国），青链霉素混合液 100（Solarbio，中国），胰蛋白酶消化液（Solarbio，中国），噻唑蓝（MTT）（Beyotime，中国），结晶紫染色液（Solarbio，中国），4%多聚甲醛溶液，Fer-1（MedChemExpress，美国），活性氧（ROS）检测试剂盒（Beyotime，中国），BCA 蛋白浓度检测试剂盒（Beyotime，中国），Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒（Beyotime，中国），GPX4 抗体（SAB，美国），ACSL4 抗体（Abcam，美国），Keap1 抗体（Abcam，美国），p-Nrf2（Abcam，美国）。1.2PMSA 的制备10PMSA 合成物储存在二甲基亚砜（DMSO）中，终浓度为 25.90 mmol/L，使用前用DMEM 将PMSA 原液稀释至一定浓度，并用 0.22 m 微孔膜过滤。1.3细胞系与培养条件实验所用的人卵巢癌细胞系SKOV3 为本实验室保存。培养条件：DMEM 培养基、10%血清（FBS）、1%青链霉素混合液，于 37、5%CO2培养箱中培养，传代次数10 代。1.4细胞活力的检测取对数生长期的SKOV3 细胞 5 000 个/100 L 接种至 96 孔板，设置对照（NC）组和实验组，细胞培养至贴壁后，NC 组加入培养基，实验组加入不同浓度的PMSA 或/和Fer-1，处理后置 37、5%CO2培养箱培养 48 h，然后每孔加入 20 L MTT（5 g/L），继续培养 4 h，弃孔内培养液，每孔加入 150 L DMSO 溶液，摇床低速震荡 10 min 加速溶解，用酶标仪在 490 或570 nm 处测定吸光度值（OD 值），计算细胞活力。1.5流式细胞术检测细胞死亡的情况取对数生长期的SKOV3 细胞，1105接种至 12 孔板。分为NC 组、PMSA（10 mol/L）组、Fer-1（1 mol/L）组、PMSA+Fer-1（10 mol/+1 mol/L）组。常规培养48 h 后，用不含EDTA 的胰酶消化收集细胞。预冷的PBS 洗涤细胞 2 次，重悬，依次加入Annexin V-FITC和PI 染色液，轻轻混匀，避光、室温孵育 1030 min 后立即用流式细胞仪检测分析。1.6活性氧检测试剂盒检测细胞内活性氧（ROS）的表达取对数生长期的 SKOV3 细胞，1105接种至12 孔板。分为NC 组、PMSA（10 mol/L）组、Fer-1（1mol/L）组、PMSA+Fer-1（10 mol/+1 mol/L）组。常规培养 48 h 后，弃上清，PBS 轻轻润洗细胞 23 次，各孔加入 1mL 无血清培养基稀释的DCFH-DA 探针（11 000 稀释至终浓度为 10 mmol/L），37 培养箱避光孵育 30 min。弃上清，无血清培养基洗涤 3 次，PBS 重悬收集细胞，立即用流式细胞仪分析检测。1.7Western blot 检测细胞内铁死亡相关信号通路的表达取对数生长期的SKOV3 细胞接种于 6 孔板，贴壁后，实验组分别加入浓度梯度的PMSA，37、5%CO2培养箱培养 48 h 后收取细胞，加入 RIPA 裂解液提取总蛋白，Bicinchoninic acid（BCA）法蛋白定量后进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，电转至聚偏氟乙烯（PVDF）转印膜。先后用兔抗 GPX4、ACSL4、p-Nrf2、Keap1 多克隆一抗、辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔第二抗体孵育，结果以化学发光法显示。1.8分子对接从PDB 数据库中获得GPX4（PDB ID：2GS3）的晶体结构，对接前分别构建蛋白质和配体分子，然后使用Discovery Studio 执行分子对接（LibDock），将PMSA分子插入GPX4 蛋白结合位点，对接后计算分子对接数值（LibDockScore）以判断PMSA 与GPX4 的结合程度。1.9统计学处理采用Graphpad Prism 8.0 软件进行统计，数据以x-s 表示，组间比较采用one-way ANOVA 分析，以P0.05 表示差异有统计学意义。2结果2.1PMSA 对SKOV3 细胞活力的影响与NC 组比较，随着PMSA 浓度的升高，SKOV3细胞活力显著降低（P0.05 或 0.01），见图 1。NC 2.55102040050100150药物浓度/(mol/L)细胞活力/%与NC 组比较：*P0.05，*P0.05），而2 mol/L Fer-1 对细胞略有细胞毒性（P0.05），因此我们采用 1 mol/L Fer-1 用于后续实验，见图 2。细胞凋亡检测结果显示，NC、Fer-1、PMSA、PMSA+Fer-1 组中的Annexin-V+/PI+细胞比率分别为（5.070.50）%、（3.840.84）%、（12.100.79）%和（7.950.28）%。与NC 组比较，PMSA 可以显著增加SKOV3 细胞死亡率（P0.01），而Fer-1 则显著抑制PMSA 作用下细胞死亡率的升高（P0.01），见图 3。此外，ROS 检测结果显示，NC、Fer-1、PMSA、Fer-1+PMSA 组的ROS 表达量分别为（4.700.12）%、（4.200.28）%、（14.770.31）%和（5.630.15）%。与NC 组比较，PMSA 可以显著增加SKOV3 细胞内ROS 的含量（P0.01），而Fer-1 则显著抑制PMSA 作用下细胞内ROS 的产生（P0.01），见图 4。2.3PMSA 对SKOV3 细胞内铁死亡相关信号通路蛋白表达水平的影响与 NC 组比较，随着 PMSA 浓度的升高，GPX4和 p-Nrf2 蛋白表达水平呈剂量依赖下降（P0.05），见图 5。2.4PMSA 通过靶向GPX4 基因诱导SKOV3 细胞发生铁死亡如图 6 所示，PMSA 能与GPX4 蛋白进行对接，LibDockScore 为 88.05，二者在氨基酸ARG36 处形成一个距离为 2.65 的氢键。3讨论卵巢癌由于具有早期症状不明显、预后差等特点，NC0.10.20.40.60