牛源无乳链球菌对喹诺酮耐药的基因特征_孟肖潇.pdf

收稿日期:20220928修回日期:20221108基金项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2020D01B15);新疆维吾尔自治区重大科技项目(2020A01001)作者简介:孟肖潇(1990)，女，助理研究员研究方向:动物疫病防治Email:meng355 126com通信作者杨学云(1978)，男，副研究员研究方向:动物疫病防治Email:yangxyxj 163com牛源无乳链球菌对喹诺酮耐药的基因特征孟肖潇，吴建勇，洪都孜波拉提，李建军，古努尔吐尔逊，努尔拜合提努尔旦，杨学云(新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆 乌鲁木齐 830010)摘要:采用微量肉汤稀释法测定左氧氟沙星、诺氟沙星和环丙沙星 3 种喹诺酮类药物对 110 株奶牛隐性乳腺炎无乳链球菌(分离自中国 10 省区 21 个规模化奶牛养殖场)的最小抑菌浓度(MIC)，通过 PC 检测 gyrA、gyrB、parC 和 parE 基因的喹诺酮耐药决定区(QD)，并分析其突变位点结果表明:110 株牛源无乳链球菌对左氧氟沙星、诺氟沙星和环丙沙星的耐药率分别为 855%、982%、945%;左氧氟沙星耐药菌株对其他 2 种喹诺酮类药物耐药，且均发生了 QD 基因突变，氨基酸突变位点有 GyrA 的 Ser81Leu、Glu85Lys，ParC 的 Ser79Phe、Asp83Tyr，ParE 的 Asp437Asn，其中，耐药菌基因最主要的突变类型是 GyrA(Ser81Leu)+ParE(Asp437Asn)，该突变类型对喹诺酮类药物呈中高度耐药;ParC 的 Ser79Phe 或 Asp83Tyr 突变类型对喹诺酮类药物的敏感性下降，ParC 的 Ser79Phe 突变与 GyrA 的 Ser81Leu 或 Glu85Lys 突变联合时，对喹诺酮类药物高度耐开放科学(资源服务)标识码(OSID)药本研究结果对兽医临床上喹诺酮类药物的耐药控制及合理使用提供了一些依据关键词:无乳链球菌;喹诺酮耐药决定区;喹诺酮类药物;奶牛乳腺炎中图分类号:S85823文献标识码:A文章编号:1671-5470(2023)03-0359-06DOI:1013323/jcnkijfafu(natsci)202303011Characteristic of quinolone resistance gene of bovine Streptococcus agalactiaeMENG Xiaoxiao，WU Jianyong，HONGDUZIBolati，LI Jianjun，GULNUTursun，NUEBAIHETINuerdan，YANG Xueyun(Institute of Veterinary Medicine，Xinjiang Academy of Animal Science，Urumqi，Xinjiang 830010，China)Abstract:The minimum inhibitory concentrations(MIC)to levofloxacin，norfloxacin and ciprofloxacin of 110 Streptococcus agalac-tiae isolates from subclinical bovine mastitis were determined by micro-broth dilution method Quinolone resistance-determining re-gions(QD)genes in gyrA，gyrB，parC and parE were detected using PC，and the sites of mutations were confirmed using se-quencing The results showed that the resistance rates of 110 isolates of Sagalactiae to levofloxacin，norfloxacin and ciprofloxacin-were 855%，982%and 945%respectively All levofloxacin-resistant isolates were also resistant to other two quinolones and oc-curred gene mutation of QD，the amino acid mutations in GyrA were Ser81Leu and Glu85Lys，in ParC were Ser79Phe andAsp83Tyr，in ParE was Asp437Asn The dominant mutation type was GyrA(Ser81Leu)+ParE(Asp437Asn)，the strains with suchmutaion type presented moderate to high resistance to quinolones Isolates with ParC Ser79Phe or Asp83Tyr mutation presented re-duced suscepibility to quinolones，while isolates with combined mutation of ParC(Ser79Phe)and GyrA(Ser81Leu or Glu85Lys)presented high resistance to quinolones This study provides some basis for drug resistance control and rational use of quinolones inclinical veterinaryKey words:Streptococcus agalactiae;quinolone-resistance determining regions;quinolones;bovine mastitis乳腺炎是奶牛常见多发病，也是影响奶牛产奶性能的重要病因1，无乳链球菌(Streptococcus agalacti-ae)是引起奶牛乳腺炎的重要机会性致病菌，在世界各地广泛流行2 无乳链球菌传播易受卫生条件和环境因素影响，在 20 世纪 20 年代，90%的奶牛乳腺炎由无乳链球菌引起3 随着饲养条件的改善和抗菌药物的使用，当前北美地区无乳链球菌性奶牛乳腺炎所占比例已不足 5%2;而在我国，乳腺炎奶样中无乳链球菌的检出率仍高达 14%20%46，在奶牛场大罐奶中的检出率甚至超过 90%7 据统计，链球菌性奶福建农林大学学报(自然科学版)第 52 卷 第 3 期Journal of Fujian Agriculture and Forestry University(Natural Science Edition)2023 年 5 月牛乳腺炎可导致产奶量下降 37%66%8，给我国奶牛场带来较为严重的经济损失目前国内没有无乳链球菌性奶牛乳腺炎疫苗，兽医临床上一般采用抗菌药物对其进行治疗，其中，喹诺酮类药物是兽医临床上常用的治疗奶牛乳腺炎的抗菌药物9，这促使无乳链球菌在喹诺酮类药物选择压力下获得耐该类药物的能力早在 2003 年日本就首次报道了喹诺酮耐药无乳链球菌10，此后无乳链球菌对喹诺酮类药物的耐药率呈现逐年上升的趋势11，一定程度影响了奶牛乳腺炎的临床治疗效果因此对无乳链球菌进行药物敏感性检测是保障临床乳腺炎治疗效果的重要手段研究表明，喹诺酮耐药无乳链球菌主要通过 DNA 解旋酶和 DNA 拓扑异构酶基因喹诺酮耐药决定区(quinolone resistance-determining region，QD)突变、携带耐药基因质粒的横向转移以及非特异的多重药物外排泵等耐药机制实现12 其中，QD 基因突变所引起的喹诺酮耐药性较为常见喹诺酮类抗菌药物通过结合 DNA 拓扑异构酶(DNA 解旋酶、DNA 拓扑异构酶)，干扰细菌基因组 DNA 复制进而抑制细菌增殖，以达到控制细菌感染的目的DNA 解旋酶由 2 个 GyrA 和 2 个 GyrB 亚基组成，DNA 拓扑异构酶由 2 个 ParC 和 2 个 ParE 亚基组成，4 种亚基中的 QD 可发生基因突变，不同突变对喹诺酮耐药性的影响不同目前发现喹诺酮耐药人源无乳链球菌中 GyrA 的第 81 位氨基酸和 ParC 的第 79 位氨基酸发生突变最为常见1314，而牛源无乳链球菌耐药机制的相关报道较少据此，本研究对本实验室保存的110 株奶牛隐性乳腺炎无乳链球菌进行喹诺酮类药物敏感性试验及 QD 基因检测，调查了解牛源无乳链球菌对喹诺酮耐药的基因特征，旨在为无乳链球菌性奶牛乳腺炎的临床治疗提供参考资料1材料与方法11材料111菌株来源110 株无乳链球菌由本实验室保存，于 20142017 年分离自中国 10 省区 21 个规模化奶牛养殖场的隐性乳腺炎奶样4，其中，新疆 49 株、内蒙古 18 株、四川 11 株、山东 8 株、辽宁 8 株、河南4 株、浙江 4 株、陕西 4 株、山西 3 株、海南 1 株质控菌株为无乳链球菌 ATCC27956112主要试剂细菌基因组 DNA 提取试剂盒、DNA Marker、2Taq Plus PC MasterMix 购自北京天根公司;左氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星购自北京索莱宝科技有限公司;高分辨率琼脂糖-1000 购自 Life Tech-nologies 公司;CAMHB 培养基购自青岛海博公司;常规试剂均为国产分析纯12药敏试验将试验菌株和质控菌株分别划线接种于改良的格拉纳达固体培养基上培养 3648 h15，挑取单菌落接种于含 50 mLL1裂解马血的 CAMHB 液体培养基中，采用美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的微量肉汤稀释法16 检测左氧氟沙星、诺氟沙星和环丙沙星对 110 株无乳链球菌的最小抑菌浓度(mini-mum inhibitory concentration，MIC)在该检测标准中，无乳链球菌对左氧氟沙星的 MIC2 gmL1为敏感菌株，2 gmL1MIC8 gmL1为中介菌株，MIC8 gmL1为耐药菌株;而该标准没有无乳链球菌对诺氟沙星和环丙沙星敏感性的推荐判定值因此，本研究根据菌株 MIC 的不同对左氧氟沙星、诺氟沙星和环丙沙星的敏感性程度进行了分类:敏感，MIC2 gmL1;低度耐药，2 gmL1MIC8 gmL1;中度耐药，8 gmL1MIC16 gmL1;高度耐药，MIC16 gmL113QD 基因的检测131基因组 DNA 的提取将无乳链球菌接种于改良的格拉纳达固体培养基上培养 3648 h，挑选单菌落接种至 5 mL TSB 液体培养基中，于 37 培养 24 h 后采用细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取无乳链球菌基因组 DNA132QD 基因的 PC 扩增及测序参考文献 13 的方法设计无乳链球菌 gyrA、gyrB、parC 和 parE 基因的特异性引物(表 1)，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成PC 扩增产物经 15%琼脂糖凝胶电泳分析并交由生工生物工程(上海)股份有限公司测序测序后与 GenBank 数据库上的 NC004116 序列063福建农林大学学报(自然科学版)第 52 卷进行比对以确定其突变位点表 1QD 基因 PC 引物序列Table 1PC primer sequences of QD genes基因名称引物序列(53)上游引物下游引物退火温度产物长度bpgyrACGAGTTTTATCGATTACGCCATCACCAAGGCACCAGTAGG55511gyrBCTGCTTCCAAAACAGGTCGCGGAGAAGATGTTCGTGAAGG55644parCAAGGGATTTCGCAAATCTGCTCCTTGAA