牛膝治疗糖尿病周围神经病变的作用机制_童雅琴.pdf

第 卷第期湖北工业大学学报 年 月 收稿日期 第一作者童雅琴（），女，湖北宜昌人，湖北工业大学硕士研究生，研究方向为药剂学 通信作者张迎庆（），女，湖北蕲春人，药学博士，湖北工业大学教授，研究方向为天然药物 文章编号 （）牛膝治疗糖尿病周围神经病变的作用机制童雅琴，肖文惠，牟彦竹，张迎庆（湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北 武汉 ）摘要为探讨中药牛膝治疗糖尿病周围神经病变的机制，分别采用网络药理学及分子对接，对牛膝治疗糖尿病周围神经病变的活性成分进行预测。研究结果表明：网络药理学分析，筛选得到牛膝对糖尿病周围神经病变治疗有效成分 种，关键靶点主要为 、和 。功能富集分析结果表明，牛膝可能通过协同调节 、等多种生物途径来治疗糖尿病周围神经病变。分子对接结果表明，红厚壳内酯是一种具有良好分子对接性能的先导化合物。本研究阐明了牛膝治疗糖尿病周围神经病变的活性成分和作用机制，为寻找治疗糖尿病周围神经病变的先导化合物和新药研发提供了理论依据。关键词牛膝；糖尿病周围神经病变；网络药理学；分子对接 中图分类号 文献标识码糖尿病周围神经病变（，）属于糖尿病的常见慢性并发症之一，致残率高，对患者的睡眠、情绪等产生负面影响，导致其生活质量下降。研究表明，糖尿病病程越长，的发病率越高，会给整个卫生保健系统和整个社会带来沉重的经济负担。主要分为周围神经病变和自主神经病变。临床患者多有双侧对称性麻木的症状，疼痛表现为刺痛、灼痛，多于夜间加重，同时伴有四肢发凉和麻木感。若伤及运动神经，患者还会出现不同程度的肌力减退，肌腱反射消失等情况。自主神经病变患者会影响心脏功能、胃肠道功能和泌尿生殖系统功能等方面的生理活动。的发病机制比较复杂，即使该病在临床上很常见，但其具体发病机制到目前为止仍不明确，大部分研究人员认为 与神经营养因子缺乏密切相关。最近有学者提出 的发病机制可能与感觉神经元及信使核糖核酸（）的变化有关。目前，国外治疗 开始专注于改善患者能量代谢的过程，包括提高患者氧化应激反应能力等。中医药防治 具有明显优势，且安全性高，已成为临床、科研和新药研发热点。中医药治疗 的方法包括中药汤剂治疗、中药注射液、针灸疗法、中医外治疗法等，可有效缓解 患者的临床症状。近年来，中药在治疗 上临床疗效较好，也越来越受到关注。中国药典收载牛膝为苋科植物牛膝（）的干燥根。牛膝具有活血祛淤、补肝肾、引血下行的功效，临床用于淤血阻滞的月经不调、下肢无力等症，对心血管系统、免疫系统、血液系统和神经内分泌系统等都有一定的作用。牛膝 在 临 床 上 可 与 黄 芪、白 术 等 配 伍 用 于 治 疗 。研究表明，牛膝提取物具有明显的降血糖作用，可在一定程度上降低型糖尿病大鼠胰岛素抵抗程度，提高其抗氧化能力，改善糖代谢。本研究目的在于通过中药网络药理学和分子对接的方法，探究牛膝对 的作用机制，并且结合文献，对所得到的化学成分、关键靶点、信号通路等信息进行分析，为以后深入研究提供理论基础。实验材料及方法化学成分筛选及化学成分潜在靶点收集本研究采用 数据库（：）检索牛膝相关的潜在靶点。以口服生物利用度（）和类药性（）为筛选指标评价所选出来的化合物，值越高，通常表示成分越可能成为药物。过滤条件为生物利用度大于，同时类药性大于 的化学成分。疾病靶点的筛选利用 （：）数 据 库，检 索 疾 病 相 关 基 因。是人类基因的综合数据库，可以提供所有已知和预测的人类基因。蛋白质相互作用（）网络的构建利用 软件，绘制牛膝与疾病靶点的维恩图，得到相关 表格 数 据，利 用 网 络 图 像 化 软 件 构建药物调控网络，利用 软件进行 网络的构建及分析。和 富集分析为了进一步了解上述筛选出的靶标蛋白基因的功能，以及在信号通路中的作用，将筛选得到的靶点，进行（）生物学过程富集分析和 （）信号通路富集分析。为了使结果具有统计学意义，入选条件为，以（）结果前 位与 结果前 位进行展示。成分靶点分子对接在以上结果基础上，选择 网络中“”最大的靶点作为受体，将潜在靶点蛋白名称输入 数据库（：）和 数据库（：），找到相应蛋白的结构，并且利用 软件进行去水和去除残基处理。在 数 据 库（：）和 （：）检索筛选所有对应靶点的化合物 结构。利用 软件和 软件将所得分子结构进行修饰处理。利用 进行蛋白分子加氢处理，找到相应的活性口袋，然后依次进行分子对接，得到分子对接得分数据。实验结果分析牛膝主要活性成分筛选通过分析平台检索到牛膝中化合物成分，根据参考条件筛选出成分 个，包括：槲皮素、山柰酚等黄酮类成分；黄连碱、表小檗碱等生物碱类成分；菠甾醇、菠甾醇、谷甾醇和豆甾醇等甾醇类成分；蜕皮甾酮等甾酮类成分（表）。表牛膝主要活性成分筛选结果 分子名中国名 黄酮苷 脱皮甾酮 黄连素 黄连碱 汉黄芩素 豆甾醇 黄芩素 黄苓苷 表小檗碱 谷甾醇 红厚壳内酯 山奈酚 菠甾醇 豆甾醇 非洲防己碱 胡萝卜苷 槲皮素 牛膝活性成分 靶点交集图牛膝治疗 潜在作用靶点的预测研究共筛选到牛膝有效成分作用靶点 个，疾病靶点 个。药物与疾病靶点的交集图见图。由图 可见，两者交集靶点共 个。由图 可见，在该网络中，共包含节点 个，其中牛膝（）、节点各个，牛膝有效成分节点 个（表内 个牛膝有效成分中，有个成分无对应的 靶点）分别是槲皮素、山柰醇、汉黄芩素、黄连素、黄连碱、黄芩素、表小檗碱、谷甾醇、海棠果素、豆甾醇和大黄藤素。对应靶点较多的成分为槲皮素，对应 个靶点，提示牛膝中治疗 的关键成分可能为槲皮素。其次为山柰醇和汉黄芩素。与这些成分相连接的靶点数目比较靠前，在牛膝治疗 的过程中，这些成分比较重要。牛膝治疗 潜在作用靶点共 个。图牛膝活性成分治疗 潜在靶点网络第 卷第期童雅琴，等牛膝治疗糖尿病周围神经病变的作用机制关键作用靶点的 网络分析牛膝治疗 的 网络见图，由图 可见，该网络中共有节点数为，边数为 ，平均节点度为，平均局部聚类系数为 。牛膝治疗 的关键靶点见图，可见节点度值较高的靶点蛋白包括、和 等，它们可能在牛膝治疗 中发挥关键作用。（）不同靶点之间的相互作用关系（圆圈代表不同的基因靶点）（）牛膝治疗 的关键靶点（仅显示前 位关键靶点）图牛膝治疗 的蛋白网络分析 富集分析结果及 富集结果分析将功能相似的基因进行富集整理，将值从大到小排列。图中，横轴代表基因的数目，颜色代表不同功能之间的显著性差异。通过 共富集到 个条目，将生物学功能较前的 个条目进行排名，结果如图所示。其中，细胞因子结合活性共 个靶点，细胞因子活性有 个靶点，磷酸酶结合靶点为 个，还有核受体的活性和转录因子活性等。通过 富集到了多个信号通路，牛膝治疗 主要集中在 、信号通路、信号通路、内分泌抵抗、信号通路，表明牛膝治疗 的过程是多通路协调的过程。这些通路可以作 为 后 期 牛 膝 治 疗 的 研 究 方 向，其 中 信号通路与 相关靶点数目最多。分子对接结果分析结合前期的分子对接研究基础，选取靶点疾病关键靶点 （：），分别与 个化合图（）生物富集分析条形图图富集基因数排序前 位的信号通路物进行分子对接，对接结果如表所示。可以看出，虽然槲皮素（）是靶点最多的化合物，但其与 的结合能力不如红厚壳内酯（）稳定。虽然目前对红厚壳内酯的研究较为局限，但其是一种具有良好分子对接性能的先导化合物。选择最优的对接结果进行可视化作图（图）。图中绿色的是晶体结构里面的原有配体，蓝色部分是化合物分子，可以看出二者结合位置相近，红色标注出来的是有关键作用的残基，说明红厚壳内酯（）通过与 的 、残基进行对接。表牛膝主要活性成分与 分子对接结果化合物 分子名 图中虚化部分是蛋白晶体结构，红色标注出湖北工业大学学报 年第期图红厚壳内酯（）与 分子对接结果来的是有关键作用的残基，绿色的是晶体结构里面的原有配体，蓝色的是红厚壳内酯（）化合物分子。讨论与结论牛膝属于活血化瘀类药物，在治疗 中起着重要的作用。实验结果共筛选得到了 个活性成分，其中已经有文献证实的能够治疗 且有实验研究的成分有槲皮素、黄连素、黄芩素 ；少量文献表示黄连碱、表小檗碱、谷甾醇等有一定的降糖作用，但未研究其与 的关系；汉黄芩素，红厚壳内酯，山柰醇，豆甾醇，大黄藤素与糖尿病及其并发症的研究暂无报道。结果提示，槲皮素为牛膝治疗 过程中靶点最多的成分，其次是山柰醇和汉黄芩素，这些成分在牛膝治疗 的过程中可能有主导作用。在治疗 的过程中，起着重要作用的靶点为、和 。通过文献查阅，本研究所得的牛膝治疗 的相关重要靶点和治疗机制已得到部分验证。其中 是 激酶的 种 紧 密 相 关 蛋 白 激 酶 之 一，研 究 显 示 与 相关的 牛膝成分有槲皮素 和谷 甾 醇 等。即白细胞间介素，在免疫细胞的成熟、活化、增殖和 免 疫 调 节 等 一 系 列 过 程 中 均 发 挥 重 要 作用，研究显示调节 相关的牛膝成分为槲皮素和汉黄芩素等。临床上治疗 的药物依帕司他，可明显改善患者临床症状，降低血清 ，槲皮素、汉黄芩素与依帕司他作用靶点相同。是一种与细胞凋亡信号通路有关的重要的酶。细胞凋亡受到细胞内凋亡调节蛋白的调控，家族是细胞凋亡过程中发挥关键作用的一组半胱氨酸蛋白酶，而其中的 在凋亡级联反应中是最为关键的凋亡蛋白酶。本研究中与 相关牛膝成分有槲皮素和山柰酚等，其中槲皮素可能会激活 信号通路促进细胞的凋亡，通过抑制 的活性，可以减少高糖诱导的细胞凋亡，控制血糖平稳。牛膝治疗 主要集中在 信号通路、信号通路和 信号通路等。与免疫炎症系统 信号通路相关的靶点基因包括 、等。信号通路是 富集的所有通路中显著性最高的通路，信号通路在调节血管的生成、葡萄糖代谢及 细 胞 的 凋 亡 和 自 噬 方 面 具 有 重 要 作 用。信号通路与糖尿病的异常代谢有关。与该通路 相 关 的 靶 点 在 本 实 验 中 有 个，包 括 、等，与牛膝中多个成分相 关。已 有 文 献 报 道 证 实，槲 皮 素 可 以 增 加 的表达水平和促进 磷酸化来上调葡萄糖转运载体的表达，促进糖的吸收和利用，增加胰岛素受体的敏感性，改善胰岛素抵抗。信号通路是胰岛素转导中一个关键信号通路，是 （）大家族中的亚族，在代谢紊乱、人类寿命和肿瘤抑制中发挥重要作用。蛋白因子是胰岛素信号通路的最终效应因子，通常通过诱导肝脏中的糖异生、抑制脂肪细胞和心肌细胞分化，或将肌肉中的燃料利用从葡萄糖转移到脂质来应对营养物质的减少。因此，蛋白的失调与胰岛素抵抗、饮食肥胖和型糖尿病的发病机制有关。根据实验结果推测牛膝可以通过调控、等靶点来上调 表达量，起到对细胞氧化应激的保护作用。有效预防和控制糖尿病及其并发症疾病发生，一直是国内外生物医学科学领域的国家需求。本研究通过网络药理学、分子对接探讨了牛膝在治疗 的过程中的作用机制，发现牛膝中的槲皮素、汉黄芩素、红厚壳内酯等活性成分值得进一步深入研究，为临床上牛膝治疗 及相关药物研发提供了新的理论依据。参考文献 ，：，（）：谷绍飞，杨叔禹 糖尿病周围神经病变不同临床表现的中医病理分布的相关研究 第九届海峡两岸中医药发展与合作研讨会、第十五次全国中医糖尿病大会暨中国针灸学会砭石与刮痧专业委员会年会论文集，：郑敏，杜义斌，陈必勤，等中西医结合抗氧化应激对糖尿病周围神经病变的临床研究云南中医中药杂志，（）：，：第 卷第期童雅琴，等牛膝治疗糖尿病周围神经病变的作用机制 ，（）：，：，（）：单留峰 温经养血活血通络类中药治疗糖尿病周围神经病变的效果研究 临床研究 ，（）：邸维莹，方朝晖 中医药对糖尿病周围神经病变防治新进展 中医药临床杂志 ，（）：张明珠，李娜，虞梅 中医药治疗糖尿病周围神经病变临床研究进展 山西中医，（）：国家药典委员会 中华人民共和国药典 北京：化学工业出版社，张伏芝 基于网络药理学的糖尿病周围神经病变气虚血瘀证组方筛选与优化 北京：北京中医药大学，黄娟娟有氧运动联合白芷、怀牛膝提取物干预对型糖尿病大鼠糖脂代谢及氧化应激的影响开封：河南大学，薛胜霞，金丽琴，贾东明等牛膝多糖衍生物对糖尿病大鼠血糖及血脂的影响中国药学杂志 ，（）：王宝江，张家英，李丹，崔