牛lncRNA_H19过表达载体构建_刘晓军.pdf

中国牛业科学 2023，49(1):41-45China Cattle Science科学试验牛 lncNA H19 过表达载体构建刘晓军1，郝琴琴2，李鹏飞2*(1 山西省忻州市繁峙县金山铺乡综合便民服务中心，山西 繁峙 034300;2 山西农业大学生命科学学院，山西 太谷 030801)摘要:目的 构建以及鉴定牛 lncNA H19 过表达重组载体，为进一步探究 lncNA H19与 miNA 491 和牛 CAT 基因的互作关系奠定试验基础。方法 NCBI 获取牛 lncNA H19序列，经聚合酶链式反应(PC)扩增，双酶切后载入 pcDNA3 1 EGFP 载体得到重组质粒。将 pcDNA3 1 EGFP H19、miNA 491 和 CAT 3 种质粒共转染至 HEK293T 细胞，在细胞内反复扩增过表达之后，利用荧光定量技术检测 pcDNA3 1 EGFP H19 的表达量。结果 结果显示 pcDNA3 1 EGFP H19 载体序列正确;293T 细胞绿色荧光达50%，且强度适中，说明转染效果良好;lncNA H19 在 293T 细胞中显著表达。结论 pcDNA3 1 EGFP H19 载体构建成功，试验将为后续探究 lncNA H19 与 miNA 491 和 CAT 基因之间的互作关系创造试验条件。关键词:pcDNA3 1 EGFP H19;荧光定量技术;CAT;细胞转染中图分类号:Q782文献标识码:A文章编号:1001-9111(2023)01-0041-05收稿日期:2022-10-20修回日期:2022-12-06基金项目:山西省应用基础研究计划面上项目(20210302123380);山西农业大学校地合作项目(2021HX23，2022HX010);山西省现代农业产业技术体系建设专项作者简介:刘晓军(1990)，男，大专，兽医师，主要从事畜牧管理和技术服务工作。*通讯作者:李鹏飞(1978)，男，博士，教授，主要从事动物生殖生理方面的研究。0前言牛属于单胎动物，在发情周期中，只有一个优势卵泡能够发育成熟并排卵受精，其余从属卵泡将会闭锁停止发育1。可卡因苯丙胺调节转录肽(co-caine-and amphetamine regulated transcript peptides，CAT)是一种下丘脑分泌的内源性神经肽，最早是在羊下丘脑中被发现的2。关于 CAT 的功能研究主要集中于 CAT 对激素内分泌的影响，CAT 通过抑制雌激素分泌，在牛卵泡发育中发挥重要负调控作用。长链非编码 NA(long non-coding NA，ln-cNA)序列长度在 200 nt 以上，不具有编码蛋白的功能。近年来研究发现，lncNA 在细胞生理活动中发挥着不可替代的调控作用，包括细胞增殖与凋亡、细胞分化、细胞衰老等。非编码 NA 广泛参与雌性动物卵泡发育过程，其中 MicroNAs(miNAs)和lncNA 能够以内源性竞争 NA(competing endoge-nous NAs，ceNA)的形式参与基因调控。课题组前期通过构建牛 CAT 基因过表达载体验证 miNA491 通过靶向调控 CAT 基因 3 UT 区域，使mNA 的表达极显著下调3;后期通过生信预测发现牛 lncNA H19 是 miNA 491 的 ceNA，lncNAH19 可能通过靶向吸附 miNA 491 从而调控牛CAT 基 因 的 表 达。但 是，lncNA H19 与 mi-NA491 和牛 CAT 基因的互作关系尚未得到验证。本试验通过 Xho I、Sac I 酶切割 lncNA H19 序列与pcDNA3 1 EGFP 载体，构建 lncNA H19 过表达载体，为后续验证 lncNA H19 与 miNA 491 和牛CAT 基因的互作关系奠定试验基础。1材料与方法1 1材料仪器山西农业大学生命科学学院保存的 HEK 293T 细胞株;实验室已购牛 CAT 过表达载体和miNA 491 mimics;胎牛血清(FBS)购自 ScienceCell公司;PBS 缓冲液、胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)均购自索莱宝公司;pcDNA3 1 EGFP 载体质粒购自武汉金开瑞公司;试验所需试剂盒 TransIntroTMEL Transfection eagent 和高纯度质粒大量提取试剂盒分别购自北京全式金公司以及上海碧云天实验室。试验所需仪器有 CO2培养箱、GloMax Multi 酶标仪、恒温振荡培养箱和细胞计数仪等。1 2试验方法1 2 1lncNA H19 过表达载体构建根据 NCBI数据库中 lncNA H19 序列，扩增目的序列并在 5端加入 Xho I 酶切位点，在 3段加入 Sac I 酶切位点并对 pcDNA3 1 EGFP 载体进行双酶切，酶切反应条件如下:10 Buffer 添加 5 L，Sac I 限制酶、Xho I限制酶各 1 L，pcDNA3 1 EGFP 载体 5 L，ddH2O 38 L。得到的混合体系置于37 条件下反应2 h。将目的片段链接于载体上，载体连接反应体系如下:T4 DNA ligase buffer、pcDNA3 1 EGFP 载体各 2 L，T4 DNA ligase、目的片段各 1 L，ddH2O14 L。1 2 2转化感受态细胞与质粒抽提将大肠杆菌接种于 LB 液体培养基中，37 振荡培养 24 h;用无菌玻璃棒涂布于富含卡那霉素的 LB 固体培养基，待培养基凝固后，37 倒置培养 16 h，观察蓝白斑菌落，挑取多个单一白色菌落，振荡培养并大量扩增获得感受态细胞。取 50 L 感受态细胞于无菌无酶的 EP 管中并置于冰上，加入 5 L 目的载体轻轻混匀，静置 25 min;42 水浴 45 s，快速置于冰上，静置 2 min;加入 800 L 不含抗生素的 LB 液体培养基，混匀后 37 250 r/min 振荡培养 1 h;取细胞混合液涂布于固体 Kanamycin LB 固体培养基上，37 倒置培养 16 h。观察蓝白斑菌落，挑取多个单一白色菌落分离于含 50 g/mL 氨苄青霉素 LB 液体培养基中，振荡培养并大量扩增。将菌液送至生工生物工程(上海)有限公司测序。按照 E Z N A Endo FreePlasmid DNA Mini Kit 去内毒素质粒提取试剂盒说明书进行质粒抽提，获取重组质粒，用于后续293T 细胞的转染。12 3细胞培养与质粒转染复苏实验室冻存的293T 细胞，将细胞接种于含 10%胎牛血清(FBS)高糖 DMEM 培养基中，在 37、5%CO2培养箱中培养。将细胞按照 2 5 104个/孔接种于 24 孔板，培养 12 h 后，细胞密度为 50%60%时将完全培养基换成无血清培养基后进行转染。将实验室已购CAT 过表达载体、miNA 491 mimics 以及 pcD-NA3 1 EGFP H19 重组质粒设置为一组;CAT过表达载体、pcDNA3 1 EGFP H19 和 NC mimic为一组;空白对照为一组，3 种质粒按照物质的量为1 1 1 进行配制。将三组质粒分别与 DMEM 培养基混匀，取 12 L TransIntroTMEL 转染试剂与 200L DMEM 培养基轻轻混匀，室温静置 20 min。1 2 4荧光定量测定 lncNA H19 表达量细胞转染 24 h 后，将细胞取出无菌室，弃上清，用 PBS 洗两次。每孔加 Trizol 试剂1 mL，充分吹打混匀，消化3 5 min。提取细胞内总 NA 并检测浓度和纯度;进行反转录得到 cDNA，收集 cDNA 用于下一步CAT 和 lncNA H19 荧光定量 PC。miNA 去除基因组反应体系如下:总 NA(3 5 10 g)体积44 L，DNase Buffer(10 )5 L，DNase(5U/L)0 5 L，无核无酶水使最终体积为 50 L。miNA 反转录体系如下:上述 NA 反应溶液(0 25 8 g)3 75 L，mQ Buffer(2 )5 L，mQEzyme 1 25 L。MiNA 491 扩增体系:TB GreenAdvantage Premix(2 )12 5 L，10 mol/L miNA specific primer、mQ3Primer 各 0 5 L，cDNA 2L，ddH2O 9 5 L。CAT 基因和 lncNA H19 扩增体系:TB Green Premix Ex Taq(Tli NaseH Plus)(2)10 L，cDNA 2 L，正反引物各 0 8 L，无核无酶水使最终体积为 20 L。扩增条件:95 孵育 10min;PC 反应预变性 95 15 s;60 退火 1 min，72 延伸20 s，设置40 个循环;溶解曲线阶段95 15 s，60 1 min，95 15s。引物序列见表 1 actin 为 CAT 和 lncNA H19 的内源性对照。U6用作 mi 491 的内源性对照。数据结果通过GraphPad Prism 9 0 软件进行单因素方差分析。表 1荧光定量引物信息基因正向引物反向引物U6F:GGAACGATACAGAGAAGATTAGC:TGGAACGCTTCACGAATTTGCG actinF:GGGACCTGACTGACTACCTC:TCATACTCCTGCTTGCTGATmi 491F:ATAGTGGGGAACCCTTCCATGAGGCATF:CCTGCTGCTGCTGCTACCTTTG:CCACGGCGGAGTAGATGTCCAGH19F:GGTCCTTGCTCTCCTGGTCTCC:CGATATCACCTGTGCTGCCTGAC2结果与分析2 1pcDNA3 1 EGFP H19 质粒测序Xho I、Sac I 酶切割 lncNA H19 片段，构建目的片段，连接于 pcDNA3 1 EGFP 载体，构建 pcD-NA3 1 EGFP H19 转化重组载体转化 DH5 感受态细胞。如图 1 所示，测序结果表明过表达载体构建成功。24中国牛业科学第 49 卷2 2细胞培养与转染效果检测293T 细胞边缘清晰，生长活跃，培养基内看不到悬浮的细胞和碎片如图 2a 所示，细胞培养至密度达 50%60%时，符合转染要求进行转染，转染效果如图 2b。观察 293T 细胞转染后，细胞状态良好，绿色荧光蛋白含量达 50%且荧光强度适中，表明质粒合格，转染操作无误。图 1重组质粒测序部分图谱图 2293T 细胞转染效果(10 )2 3LncNA 表达量分析通过荧光定量 PC 测定 lncNA H19 表达量，如图 3 显示，lncNA H19+NC+CAT 组和 lncNAH19+miNA 491+CAT 组与未转染空白组 293T细胞相比，lncNA H19 均有表达，说明 lncNA H19过表达载体成功转染 293T 细胞，载体构建成功。lncNA H19+NC+CAT 组与 lncNA H19+mi-NA 491+CAT 组相比极显著表达(P 0 001)，证明 lncNA H19 与 miNA 491 有互作关系。图 3lncNA H19 过表达结果3讨论牛在一个发情周期中，往往会出现 2 3 个卵泡波。卵泡生长发育依赖促卵泡激素刺激，在卵泡发育波出现之前，促卵泡激素浓度就会出现短暂变化4。促卵泡激素和 CAT 都能够调节牛体内雌二醇的分泌，雌二醇分泌对维持优势卵泡的发育和启动性行为、促性腺激素浓度升高和排卵具有重要作用5。CAT 作为一种广泛分布于中枢神经系统于外周神经系统的内源性神经肽，通过下丘脑垂体卵巢轴调控雌激素的分泌，进而抑制牛卵泡的正常发育6。李玲玉等人7 使用不同浓度促卵泡激素处理水牛卵巢颗粒细胞，检测颗粒细胞中雌激素分泌情况发现，外源 CAT 能够抑制促卵泡激素诱导颗粒细胞中雌二醇的合成与分泌。李鹏飞等8 探究促卵泡激素浓度一定的条件下，雌二醇的分泌随着 CAT 浓度的增加而减少，