脑缺血再灌注损伤大鼠肠道菌群的变化及功能分析_梁国晶.pdf

山东医药2023 年第 63 卷第 19 期脑缺血再灌注损伤大鼠肠道菌群的变化及功能分析梁国晶1，冀琨2，任海燕3，张恺纯4，张钰鸽5，文娟11 新疆医科大学基础医学院病理生理学教研室，乌鲁木齐830011；2 新疆医科大学第六附属医院神经外科；3 新疆医科大学实验室与设备管理处中心实验室；4 乌鲁木齐市友谊医院心内科；5 长葛市人民医院病理科摘要：目的探讨脑缺血再灌注损伤（CIRI）大鼠的肠道菌群变化及其对CIRI的影响机制。方法将48只SD大鼠按随机数字表法分为Sham组、Model组各24只。Model组用线栓法阻断大鼠大脑中动脉血流2 h后恢复再灌注7 d建立大脑中动脉阻断模型，Sham组大鼠仅分离颈总动脉。再灌注7 d后，两组采集粪便标本，用16S rRNA测序技术进行肠道菌群丰度、多样性和差异性分析，用PICRUSt2分析差异菌群的功能。结果两组肠道菌群Alpha多样性比较差异无统计学意义（P0.05），两组肠道菌群结构比较差异有统计学意义（P0.05）。与Sham组比较，Model组乳酸杆菌属、颤螺菌属丰度低（P均0.05），消化链球菌科、肠杆菌科等丰度高（P均0.05）。差异菌群的功能在代谢通路富集，神经变性疾病、萜类、聚酮在Model组显著聚集（P均0.05），but there was significant difference in gut microbiota structure between the two groups（P0.05）.Compared with the Sham group，Model group had lower abundances of Lactobacillus and Oscillospira（both P0.05），and higher abundances of Peptostreptococcaceae and Enterobacteriaceae（both P0.05）.The function of differential microbiota was enriched in metabolic pathways，and Neurodegenerative diseases，terpenoids，and poly ketones were aggregated in the Model group（all P0.05）.Conclusions The gut microbiota of CIRI rats is disordered，the abundances of Lactobacillus and Oscillospira in beneficial bacteria decrease，and the abundance of Enterobacteriaceae in harmful bacteria increases.Gut microbiota may promote CIRI through neurodegenerative diseases，terpenoids and poly ketones in the metabolic pathway.Key words：cerebral ischemia-reperfusion injury；gut microbiota；16S rRNA gene sequencing technology；rats缺血性脑卒中是一种常见的中枢神经系统疾病，现已成为全球第二大致死原因和第三大致残原基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金项目（2019D01C191）。第一作者简介：梁国晶（1999-），女，硕士研究生在读，主要研究方向为神经病理生理学。E-mail：通信作者简介：文娟（1968-），女，博士研究生，副教授，主要研究方向为神经病理生理学。E-mail：开放科学（资源服务）标识码（OSID）23山东医药2023 年第 63 卷第 19 期因。脑缺血主要是动脉粥样硬化斑块形成的血栓堵塞了大脑中动脉，损害了梗死区域的脑实质1-3。脑缺血后再通血液灌注可能会加剧脑损伤，称为脑缺血再灌注损伤（CIRI）。因此，从新的角度挖掘治疗靶点对预防或减缓缺血后脑损伤有重要意义。随着16S rRNA基因测序技术的发展和对肠道菌群更加深入的研究4-6，通过“微生物-肠-脑轴”探讨神经退行性疾病的防治成为热点7-8。已有动物实验证实，肠道菌群紊乱可加重CIRI，也可通过肠道菌群防治CIRI，如益生菌干预、粪菌移植等9-10；但仍需大量研究来验证肠道菌群与 CIRI 相互作用的机制11-12。2021年1月2022年11月，本研究通过建立CIRI大鼠模型后取其粪便标本，使用16S rRNA测序技术观察CIRI大鼠的肠道菌群变化，并对差异菌种进行功能分析，为CIRI的防治提供新视角。1 材料与方法 1.1材料清洁级SD雄性大鼠48只，体质量180220 g，均购买于新疆医科大学动物实验中心，动物许可证编号SYXK（新）2018-0003。实验动物饲养环境湿度 45%55%，温度（22 2），可自由获取食物和水，适应性饲养7 d。本实验通过新疆医科大学动物实验中心伦理委员会审核（IACUC-20210114-14），实验均遵循动物实验伦理原则。QIAamp DNA Stool Mini试剂盒购自德国QIAGEN公司，NanoDrop NC2000分光光度计购自美国赛默飞公司，Quant-iT PicoGreen dsDNA 检测试剂盒购自美国 Invitrogen公司。1.2动物分组及模型制备将SD大鼠按随机数字表法分为Sham组、Model组各24只。参考文献13-14，术前禁食禁水12 h，10%水合氯醛行腹腔注射麻醉（0.35 mL/100 g），室温保持在25，取仰卧位固定于操作台上；颈部正中皮肤备皮后碘伏消毒，行纵行切口，长约 1.5 cm，逐层钝性分离皮下组织、肌组织，暴露颈总动脉并将其游离至颈内颈外分叉处，将Model组颈总动脉近心端结扎，在颈内颈外分叉稍下处剪一小口，将圆头直径0.265 mm的线拴插入，进入颈内动脉18 mm有轻微阻力后停止，扎紧固定线拴，2 h后将线拴拔出，消毒并缝合皮肤。Sham组只分离颈总动脉后消毒并缝合皮肤。1.3样本采集再灌注7 d后，用10%水合氯醛行腹腔注射麻醉大鼠后，于腹腔正中切口，采集大鼠盲肠粪便于 2 mL EP 管中，称重标记后，迅速保存于-80 冰箱内。1.4肠道菌群检测采用 16S rRNA 测序技术。QIAamp DNA Stool Mini试剂盒提取粪便样本中的微生物DNA，用引物（上游引物5-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3、下游引物 5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）对细菌16S rRNA基因的V3V4高变区进行 PCR 扩增。筛查原始数据序列质量，用 QIIME2 dada2软件聚类分类操作单元（OTU）。根据OTU在不同样本中的分布，评估每个样本的Alpha多样性和Beta多样性。用Linear discriminant analysis effect size分析两组物种丰度组成差异；基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库，用PICRUSt2预测差异菌群的功能。1.5统计学方法使用QIIME2通过置换多元方差分析、相似性分析、Permdisp分析菌群结构的差异；用MEGAN和GraPhlAn对分类学组成和丰度进行可视化；用LEfSe分析对菌群各级分类水平进行差异分析。P0.05），两组大鼠肠道菌群Alpha多样性结构相似（见OSID码图1d）。2.1.1.2Beta多样性两组肠道菌群结构差异有统计学意义（P0.05），见OSID码图1e。Sham组各样本相似度高于Model组，两组在门水平菌群组成上较相似，Model组在属水平上肠道菌群丰度低于Sham组（见OSID码图2）。2.1.2物种组成差异2.1.2.1肠道菌群组成由桑葚图可见（见OSID码图3a），在门水平上，肠道菌群主要由厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门组成，Sham组分别占59.67%、19.78%、18.74%，Model 组 分 别 占 64.55%、23.22%、9.83%。由柱状图可见（见 OSID 码图 3b、3c），在科水平上，肠道菌群主要由乳酸菌科、瘤胃球24山东医药2023 年第 63 卷第 19 期菌科、毛螺菌科、肠杆菌科等组成，在属水平上，肠道菌群主要由乳酸菌属、颤螺菌属、假单胞菌属、梭菌属、拟杆菌属等组成。2.1.2.2肠道菌群差异物种用 LEfSe 分析两组差异有统计学意义的菌种（见OSID码图4），结果显示：共鉴定出33个差异显著的菌落。Model组丰度低于 Sham 组的有葡糖球菌科、乳酸杆菌属（P 均0.05）。Model组丰度高于Sham组且在科水平的物种有噬纤维菌科、慢生根瘤菌科、黄单胞菌科、毛螺菌科、丹毒丝菌科、消化链球菌科、肠杆菌科；Model组丰度高于Sham组且在属水平的有瘤胃球菌属、经黏液真杆菌属、真杆菌属、粪球菌属、多尔氏菌属、肠球菌属、梭菌属、假单胞菌属、铜绿球菌属、脱硫弧菌属（P均0.05）。2.2肠道菌群差异物种的功能氨基酸代谢、糖代谢与能量代谢、聚糖生物合成和代谢、脂类代谢、辅因子和维生素的代谢、核苷酸代谢通路在粪便肠道菌群中富集（见OSID码图5a）；LEfSe分析发现，神经变性疾病、萜类、聚酮在 Model 组显著富集（P 均0.05），见OSID码图5b。3 讨论 肠道菌群是人体最重要的微生态系统，在人体内环境稳态中占据重要地位。肠道菌群的平衡状态与健康息息相关，在正常情况下，肠道菌群与宿主保持着动态平衡，当机体受到感染、创伤、应激、药物等内外环境刺激时，平衡被打破引起肠道菌群失调。近年来，中枢神经系统疾病的肠道菌群群落组成、功能的改变得到微生物以及神经系统疾病相关研究者的极大关注，提出“微生物-肠-脑轴”的概念，指肠道菌群与胃肠道和神经系统之间的双向沟通渠道，肠道菌群通过该轴影响大脑的功能和行为；反之，大脑也可通过该轴改变肠道菌群的组成。越来越多的证据证实，肠道菌群与神经系统疾病有关15-17。由于CIRI后肠道菌群紊乱的机制和关系复杂，利用肠道菌群作为新的筛查工具对CIRI进行早期识别及治疗具有重要意义。因此，本研究从肠道菌群的丰度、多样性、差异性分析以及差异菌功能分析等方面探讨CIRI大鼠肠道菌群的变化，为该疾病的防治提供新思路。本研究发现，Model组Alpha多样性分析结果与Sham组相比差异无统计学意义，与HU等18的研究结果一致，该研究发现缺血性脑卒中患者和健康对照组的微生物Alpha多样性和结构相似。而另一项研究发现，脑卒中后认知障碍患者的Alpha多样性明显降低19。因此，肠道菌群多样性在CIRI中的变化需进一步研究。为了确定样本之间总体群落结构的差异，进行Beta多样性分析，结果显示Sham组与Model组的肠道菌群区系结构存在差异，主要表现为变形菌门下的肠杆菌科与脱硫弧菌属、假单胞菌属等机会致病菌在Model组显著富集。肠杆菌科的增殖被认为是上皮功能障碍的标志，也是肠道菌群紊乱的指标20。与脑卒中风险增加有关的疾病中，菌群失调特征都为肠杆菌科的富集，如克罗恩病、溃疡性结肠炎和慢性肾病21-22。厚壁菌门下的致病菌肠球菌科、毛螺菌科、丹毒丝菌科和消化链球菌科也在Model组显著富集。研究发现，消化链球菌增多可显著增加肠道促炎细胞因子TNF-、IL-1等的分泌，毛螺菌科下的瘤胃球菌也可激活小鼠体内的IgA应答，在一项研究中，脑卒中患者肠道菌群失调的特征为毛螺菌科下的瘤胃球菌水平升高23，因此研究认为两种菌属可促进慢性炎症并通过免疫途径影响神经系统疾病24-26。乳酸杆菌属与颤螺菌属在Model组丰度显著减少，两种菌属为丁酸产生菌27。研究表明丁酸产生菌可以改善某些已知与卒中风险增加有关的疾病，如高血压、糖尿病和肥胖28-29，被认为是神经系统疾病的治疗靶点30。以上结