HPLC监测甲氨喋呤血药浓度方法的改进与优化_谢亦娴.pdf

书书书研究论文 监测甲氨喋呤血药浓度方法的改进与优化谢亦娴，蔡秀莺（福建省三明市大田县总医院，福建 三明 ）摘要目的：采用经过改进与优化的高效液相色谱（）法对人体血清中的甲氨喋呤（）血药浓度进行监测，评定其效能与价值。方法：采集血清样品 ，用高氯酸溶液（）进行处理，以 法实施测定。流动相：甲醇 磷酸二氢钾（，采用氢氧化钠调至 ），色谱柱：大连依利特 ，流速：，紫外检测波长：，柱温：。结果：的血药浓度位于 这一范围内，会有较好的线性关系（）。低浓度的日内、日间精密度（）分别为 、，而提取回收率是 ；中浓度分别是 、与 ，高浓度则为 、与 ；最低检测限是 。结论：经过改建与优化后的 法不仅准确、可靠，而且还有着较好的重现性，较高的灵敏度，在监测大剂量 的血药浓度当中，有着较好的应用价值。关键词甲氨喋呤；高效液相色谱法；血药浓度；优化中图分类号：文献标识码：文章编号：（），（，）：（）（），：（）：（，），：，：，：，：，（）（），；，；。：，：；甲氨喋呤（）是一种典型的叶酸类抗肿瘤药，以一种竞争性方式抑制二氢叶酸还原酶，阻止二氢叶酸还原成四氢叶酸，并对 、的合成给予阻隔，借此达到抗肿瘤的目的。在当前临床当中，在治疗恶性淋巴瘤、骨肉瘤、儿童急性淋巴细胞性白血病等疾病时，临床多采用的是 与甲酰四氢北方药学 年第 卷第期叶酸钙（）解救疗法相联合的方案，在此过程中，的用量为常用量的数倍，甚至是数十倍、百倍，另外，其在机体中的吸收、分布、生物转化与排泄，也存在着较大的个体差异。有研究指出，的毒性密切相关于其血药浓度。因此，为了能对使用大剂量 患者的用药安全提供可靠保障，强化对其 血药浓度的实时监测十分重要。当前，已出现许多用于测定 血药浓度的方法，最常用的有荧光偏振免疫分析（）法、高效液相色谱（）法等，其中，针对 法而言，在实际操作时，往往需选用专用型试剂盒，而且成本高；而对 法来讲，不仅有较高的灵敏度、较强的专属性，而且还具有低成本等优点，故在监测 血药浓度上，更具适用性。本文对 法进行了改进与优化，即构建了用高氯酸对蛋白进行直接沉淀，完后用 外标法对人血清当中的 浓度进行测定的操作方法，现就其具体效能作一剖析。材料 仪器美国 公司生产的高效液相色谱仪，囊括 数据采集处理工作站与 紫外检测器；美国贺利氏公司生产的高速低温离心机（）；天 津 恒 高 科 技 发 展 有 限 公 司 生 产 的 氮吹仪；海门市其林贝尔仪器制造有限公司生产的 微型涡旋混合仪。药品与试剂中国药品生物制品检定研究院提供的 标准品（批号：，纯度为）；高氯酸、氢氧化钠、磷酸二氢钾等试剂都是分析纯，甲醇是色谱纯。方法与结果 色谱条件柱温：；流动相：甲醇 磷酸二氢钾（，采 用 氢 氧 化 钠 调 至 ）；流 速：；色谱柱：大连依利特 ；紫外检测波长：，进样量：。于此色谱条件下，患者血清当中的 在保留时间上与 标准品相一致，都是 ，并且血清当中的内源性杂质不会干扰到测定结果，方法有着较好的专属性。色谱如图所示。图 图 配制标准溶液精确适量 标准品，置入到甲醇当中，且将 的氢氧化钠（，）加入，充分混匀后，再把适量甲醇加入，进行定容，最终配制成所需要的贮备液（），放入冰箱中（）待测；在实际使 用 时，将 其 进 行 稀 释，使 之 达 到 所 需 浓 度便可。处理血清样品精取 血清样品，将 的高氯酸溶液（）滴入，涡旋混合（时间为 ），然后离心处理 离心半径（）：，每分钟 ，时间：分钟，然后取 上清液，置入到另一离心管当中，把 氢氧化钠溶液（）加入，涡旋混合（时间 ），取出，开展进样分析。制备标准曲线及考察最低检测限精取适量的 贮备液，分别置入到正常人空白血清（）当中，使 血清样品的终浓度依次 维 持 在 、。以“”中的方法对血清进行处理后，从中精取，开展进样测定，对样品峰面积进行准确记录。将 浓度（）当作横坐标，而把经测而得到的 峰面积平均值（）当作纵坐标，计算直线回归方程，即 （）。设定最小可检测信号，即样本信噪比，最终得出的最低检测限值是 。北方药学 年第 卷第期 提取精密度以及回收率试验取 的血清样品，分别将适量 贮备液加 入 其 中，最 终 配 制 成 种 浓 度 的 样 品，即 低 度（）、中度（）与高度（），依据“”中的操作方法，对样品进行处理且进样，测定得到 峰面积 ；与此同时，进行 甲醇标准品溶液的配置（与上述浓度血清样品一样的浓度），直接实施进样，从中测定 峰面积 ，最后对不同浓度样品相对应的提取回收率进行计算（提取回收率的计算公式为：）。此外，从配制样品时开始，每日对三种浓度的血清样品进行提取与测定，在 日内需要完成次测定，然后据此对日间精密度（）值进行计算；还需指出的是，围绕不同浓度的血清样品，单日连续进行次测定，对日内 值进行计算，最终结果见表。表提取精密度以及回收率试验的结果质量浓度（）（）日内日间提取回收率（?，）稳定性试验分析进行三种不同浓度的血清样品的配制，分别是低度（）、中 度（）与 高 度（），用“”中的方法进行处理，然后静置于特 定 温 度 下（），或 者 是 置 入 冰 箱 中 冻 存（），分别于各时间点（、与 ）进行浓度测定，见表。从中可知，血清样品依据“”方法完成处理后，在 进行测定，结果并没有统计学差异（）。表除蛋白后测定各时间点的 血药浓度结果（?）时间（）测得浓度（，）测得浓度（，）取血后各时间加入高氯酸对血药浓度所产生的影响对正常人血清进行采集，然后充分混匀，最后即刻精取 ，置入到离心管当中（），把适量 贮备液加入，使其终浓度维持在 ，且静置（）；在将 予以加入后的、与 时，采用“”方法对血清样品进行处理，从中分析样品前处理方法对 整体稳定性所产生的影响，也就是血清当中的 有无出现降解情况。结果得知，血清当中的 于静态下（），在 内所得到的血药浓度结果，较之 时，并没有出现统计学差异（），如图所示。图血清当中各时间点的 结果 临床应用选取 例恶性淋巴瘤患者，其中，最小年龄 岁，最大 岁，平均为（）岁，男 例，其余均女性（例），体质量 ，平均为（），给药前肝肾功能正常。采用输液泵以特定剂量（），持续用药 ，完成用药后，即刻用甲酰四氢叶酸（）进行解救，控制好首次解救用量，即 ，在 此 之 后，固 定 用 量（每 按 ），直到 的血药浓度 ，此时便可将解救予以停止。在开始滴入 后，分别在 、时，进行静脉血（）的抽取，离心操作，得血清之后，用“”方法进行处理且予以测定，其中，例次未能检出（于 时间点），具体见表。从表中得知，不同时间点相对应的 血药浓度，呈显著的个体差异，其中，个体差异最显著的时间点为 、时。表患者血清当中所测的 浓度结果时间（）例数浓度（?，）变异系数（）讨论当前，临床多采用大剂量 来对多种恶性肿瘤（如白血病、淋巴瘤等）进行治疗。需强调的是，由北方药学 年第 卷第期于 有着较低的治疗指数，较大的毒性，而且个体之间还存在较大的代谢差异，因此，当大剂量用药后，容易出现各种严重不良反应，比如肾小管阻塞或损伤、神经毒性以及骨髓抑制等，严重者可引发死亡。血药浓度监测能够较好的将 在机体当中的浓度变化情况反映出来，因而可为个体化治疗及解救操作提供可靠支撑，故有助于临床用药合理性、规范性与安全性的提高，促进疗效的增强。有研究指出，的毒性紧密相关于其暴露在正常浓度上限的时间，而 的血药浓度可能与多因素相关，例如患者年龄、联合用药以及用药剂量等。所以，对于各个体，如果仍采用统一的解救方式，难以做到对严重不良反应的有效预防，故需强化血药浓度的监测。需指出的是，当前已出现许多处理血液样本的方法，而能否选择合适的方法，会对 法测定 结 果 的 准 确 性 产 生 直 接 影 响。有 学 者 指出，比较常用的蛋白沉淀剂为高氯酸、乙腈、甲醇及三氯乙酸等。本文分别采用以上试剂除蛋白，且开展对比试验与分析，结果得知，乙腈、甲醇的提取回收率都，究其原因，可能与 在二者当中存在着较小的溶解度相关，还可能与沉淀吸附、氮吹等操作造成的损失相关；对于三氯乙酸来讲，其在具体的提取回收率上，尽管可以，但存在着较多的杂质峰，因而会对测定结果造成干扰；而在对高氯酸进行实际选用时，本文分析了各体积比高氯酸沉淀蛋白的具体效果，发现等体积比的高氯酸（）沉淀蛋白，不仅有着较小的杂质峰干扰，而且三个浓度的提取回收率（低、中、高），都能够较好的满足检测要求。还需指出的是，在样品提取液当中，通过将适量的氢氧化钾溶液（）加入，以此来中和酸性，对仪器管路以及色谱柱的保护有利。有学者指出，血液当中含有大量的胞苷脱氨酶，其会降解阿糖胞苷（）脱氨，使之成为没有活性的阿糖尿苷。的结构与 基本相同，在其分子当中同样含有许多的伯氨基，为证实血清当中的此类酶是否会造成 的降解与转化，本文对血清当中 的相应稳定性进行了检测，发现采血且即刻进行离心处理，把血清静置保存（），在 内，其在具体的测定结果上，相比于，并没有统计学差异，故可为采血后处理标本提供一些支撑与建议。综上，通过改进、优化 法，借此对 的血药浓度进行检测，其无论是在准确性、灵敏度上，还是在重现性上，都能够较好的满足临床在监测 血药浓度的需要，而且同时还能满足药动学研究方面的要求，故可以为 的药理分析、个性化用药等提供切实依据。参考文献 孟岑，徐 刚 儿 童 急 性 淋 巴 细 胞 白 血 病 中 位点基因多态性对大剂量甲氨蝶呤血药浓度及不良反应的影响 实用药物与临床，（）：刘加涛，孙小珊，宋帅，等 全自动二维液相色谱法测定甲氨蝶呤血药浓度及其临床应用中南药学，（）：莎日娜，张冬婕，赵志刚，等超高效液相色谱串联质谱法测定人尿液中甲氨蝶呤浓度的不确定度评定中国医院药学杂志，（）：秦亚彬，李瑞宏，刘少卿，等 法快速检测儿童患者血浆中甲氨蝶呤和万古霉素的浓度 中国临床药理学杂志，（）：赵晨，兰云意，杨柱梅，等 例骨肉瘤患者大剂量甲氨蝶呤化疗后血药浓度与不良反应分析肿瘤药学，（）：唐红波，冯欣，阴赪宏，等甲氨蝶呤血药浓度和基因检测在治疗低危妊娠滋养细胞肿瘤中的价值研究中国医院用药评价与分析，（）：，（）：高源源，赵科，任璐彤，等比较高效液相色谱法和液质联用法测定化疗患者血浆中甲氨蝶呤浓度的相关性 中国临床药理学杂志，（）：袁桂艳，刘焕君，李荣，等 骨肉瘤患者行大剂量甲氨蝶呤化疗后肝功能异常及与血药浓度的相关性分析 药学研究，（）：孙培卓，薛胜楠血药浓度监测在大剂量甲氨蝶呤治疗儿童急性淋巴细胞白血病中的应用及临床意义医学理论与实践，（）：李琰，张文靓，姚敏，等 基因多态性与急性淋巴细胞白血病患儿大剂量甲氨蝶呤血药浓度和不良反应的相关性研究 中国药物应用与监测，（）：（下转第页）北方药学 年第 卷第期 具有 高 选 择 性，这 是 因 为 与 其 他 离 子 相 比，配合物具有更高的稳定性常数。在最佳反应条件下，在反应体系中加入不同浓度的 ，确定了检测 的线性范围为 至 ，相关系数为 ，检测限为 （图）。我们还评估了这种方法检测饮用水中 的可行性。通过在自来水中加入汞离子标准溶液来检测加标物的回收率，如表所示，测试了三组不同浓度的 离子，回收率均在 。表自来水 加标回收实验 （）（）（）（）结论综上所述，本文制备了具有模拟氧化酶活性的 ，探究了 的催化机制，并基于 开发了一种简便、环保的 检测方法。结果表明，可以被快速准确地检测到，并且对其他金属离子具有较高的灵敏度和选择性。与其他现有的 分析方法相比，这种新的比色法具有较高的选择性，并且可以在室温下使用肉眼或普通的紫外可见分光光度计轻松完成，具有较高的使用价值。参考文献 ，（），（）：，（）：，：，（）：，：，：，（）：，（），（）：，（）：基金项目：福建医科大学启航基金项目（：）。作者简介：林晓昀（），女，汉族，福建龙岩人，硕士，药师，研究方向：生物纳米材料的制备及应用。（上接第页）方焱，方策，孟祥晖，等 基于羟基甲氨蝶呤血药浓度监测的大剂量化疗骨肉瘤患者肝功能损伤 预 测 模 型 构 建 中 国 医 院 药 学 杂 志，（）：，（）：董婧，李婷婷，邱志霞，等 比阿培南与甲氨蝶呤、