氟暴露下SH-SY5Y细胞ERK5信号转导通路的改变_邱志伟.pdf

基础研究氟暴露下 细胞 信号转导通路的改变邱志伟，高峰，陈从山，张远洋，赵乐，刘艳洁（十堰市太和医院 康复中心，湖北 十堰；贵州医科大学 临床医学院病理学教研室，贵州 贵阳）摘 要目的 检测 信号通路中磷酸化的细胞外信号调节激酶（）及 在氟暴露下 细胞中的表达，探讨 信号通路与氟暴露下 神经损伤机制的关系。方法 用不同剂量氟化钠（，.、.、.、.、.、.、.、.、.、.及.）处理 细胞 及 ，采用 实验筛选出低和高剂量氟中毒浓度；再以正常组 细胞为参照，用低、高剂量氟化钠剂量分别处理 细胞 和 ，采用实时荧光定量 检测处理 时各组细胞的 水平，用 检测、蛋白表达水平。结果染氟处理后，.、.处理 细胞 及 细胞的存活率均低于正常对照组（.），可作为低剂量组和高剂量组的染氟剂量；染氟 时，对照组、低剂量组和高剂量组 细胞中 的 表达水平分别为.、.、.，组间比较均无统计学意义。染氟 时，蛋白高氟组较低氟组和正常组表达升高，差异有统计学意义（.），而染氟 时，染氟组 蛋白表达升高，各组间比较均有统计学意义（.），染氟 和 正常组、低氟组、高氟组 蛋白表达水平分别为（.、.、.）、（.、.、.）；染氟 后，总 蛋白升高，高氟组较低氟组、正常组有意义（.，.），而染氟 后，染氟组较正常组升高有统计学意义（.，.），染氟 和 总 蛋白表达水平分别为（.、.、.），（.、.、.）。结论 信号通路中 蛋白及 蛋白在慢性氟中毒时被激活，随着染氟时间与染氟剂量增加其表达水平出现逐渐升高，其可能参与代偿性神经保护机制对抗氟的神经毒性作用。关键词氟；暴露；信号转导通路；改变中图分类号 文献标识码 文章编号（）：，（，；，）（），（，.，）；第 卷 第 期 年 月 贵 州 医 科 大 学 学 报 基金项目国家自然科学基金（）通信作者：引用本文：邱志伟，高峰，陈从山，等 氟暴露下 细胞 信号转导通路的改变 贵州医科大学学报，（）：，；，（），（），（），（，；.，.，），；（，.）；，（，）；（，）（，），；（）；分裂原激活蛋白激酶（，）家族信号系统广泛存在于多种细胞，与神经退行性疾病有密切的关系，该系统可将细胞外刺激信号转导至细胞内、或细胞核内，使细胞发生增殖、分化、转化及凋亡，影响神经突触的传递和神经元的重塑及形态分化，对学习记忆功能发生影响。有研究发现，信号转导通路改变是慢性氟中毒性脑损伤机制中的重要参与因素。（）是 系统中的重要组成部分，信号转导通路也是 信号转导通路中较新的一条通路。细胞外调节蛋白激酶，（，）作为 家族的一员，研究表明 的活化对于细胞增殖、分化等生理过程是必需的，亦与许多疾病的发生有着一定的关系。氟离子可以通过血脑屏障在脑组织中蓄积、并造成中枢神经系统损害，长期摄入过量氟会影响神经细胞的正常生理功能，在地方性氟中毒病区的患者常出现记忆力减退、头痛、头晕及共济失调等神经系统症状。关于慢性氟中毒对神经损伤，在前期的研究较多，而 信号转导通路在氟中毒方面尚未见研究，本实验通过复制 及 细胞模型，探讨 信号通路在氟中毒 细胞中被激活的相关机制，报告如下。材料与方法.实验材料.细胞及主要试剂 细胞（德国 公司）；培养液（英国 贵 州 医 科 大 学 学 报 卷公司），胎牛血清（，美国 公司），二甲基亚砜（），氟化钠（，美国 公司），培养细胞用青霉素 链霉素（美国 公司），（日本同仁公司）；电泳系统（美国 公司），磷酸化（）、总 及抗兔（与辣根过氧化物酶联，美国 公司），发光试剂（瑞典 公司），总蛋白提取试剂、裂解液、二喹啉甲酸（）蛋白定量检测试剂盒（碧云天生物技术研究所）。.主要仪器 垂直电泳槽、电泳仪（美国 公司），型冷冻离心机（美国 公司），型脱色摇床（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司），酶标仪（美国 公司）；总 提取试剂盒（美国 公司），（上海捷瑞生物工程有限公司），合成试剂盒（美国 公司），核酸定量仪（美国 公司），仪（美国 公司）。.研究方法.低、高剂量氟浓度筛选及分组分别用不同剂量 处理 细胞、，通过 实验筛选出氟中毒实验浓度；以正常组 细胞为参照，用低、高剂量氟分别处理 细胞、，用实时荧光定量 检测染氟 各组间 水平，用蛋白免疫印迹法（）检测各实验组、的蛋白水平。.细胞培养 神经细胞又称人神经母细胞瘤细胞，应用于慢性氟中毒神经细胞模型的研究。将冻存细胞株复苏，于 培养箱中培养，后换培养基（含 胎牛血清、双抗的）继续培养，观察细胞生长状态，待细胞长满培养瓶底传代继续培养。.法筛选染氟中毒实验浓度收集对数期正常 细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入 ，铺板使待测细胞密度达 个 孔边缘孔用无菌磷酸缓冲液（）填充，孵育，至细胞单层铺满孔底（孔 平 底 板），设 置 调 零 孔（包 括 培 养 液、）、对照孔（包括细胞 培养液、），进而加入 氟 化 钠（，浓 度 梯 度为.、.、.、.、.、.、.、.、.、.及.），设 个复孔；分别培养、后，每孔加入 溶液 ，继续培养，终止培养，用酶标仪在波长 处测量各孔的吸光度（）值，计算各实验组细胞存活率，参照 实验步骤，正常 细胞染氟后筛选合适的浓度。.细胞染氟 时 表达 采用实时荧光定量 检测细胞中 信号通路中 表达。用 一步法提取细胞总，将 逆转录反应成，以逆转录模板进行实时荧光定量。的上游引物为，下游引物为，扩增产物长度 ；内参照 的上游引物为，下游引物为，扩增产物长度为 。体系为上下游引物各.，.，.），循环条件为反应条件为 ，、，个循环。用 作为内参，采用 法计算反应结果。.细胞中磷酸化（）、总 蛋白水平检测采用 法检测，提取细胞总蛋白，将细胞沉淀加入 细胞裂解液，漩涡震荡 次，每次 ，冰上静置，反复 次，离心 ，取上清液进行蛋白定量检测。经 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，再用转膜装置将胶上的蛋白转到聚偏二氟乙烯膜（）膜上，先分别用 蛋白、总 蛋白（）与转蛋白膜孵育 过夜，再与辣根过氧化物酶联结的抗兔 室温孵育 。将膜与 发光试剂反应，用显影胶片曝光，冲洗胶片后用 图像分析仪处理，用 作为内参，计算反应结果。.统计学分析数据采用 .软件处理，计量资料采用均数 标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 检验，以 .为差异有统计学意义。结果.染氟浓度的筛选染氟 时，.处理组细胞存活率较对照组（.）升高，.期邱志伟等 氟暴露下 细胞 信号转导通路的改变.处理组的细胞存活率较对照组降低，差异有统计学意义（.）；染氟 时，.处理组细胞存活率较对照（.）组升高，.处理组的细胞存活率较对照组降低，差异有统计学意义（.）。综合选择.实验组作为低剂量染氟组、染氟.实验组作为高剂量染氟组，复制神经细胞慢性氟中毒模型。见表。表 氟化钠对 细胞活力的影响（，）（，）组别（）染氟 细胞存活率染氟 细胞存活率.（）.（）.（）.（）.（）.（）.（）.（）.（）.（）.（）.（）.（）.（）.（）.（）.注：与 组比较，（）.，（）.。.表达水平 实时荧光定量采用 法计算，染氟.、.、.后，正常组、低氟组、高氟组 表达水平任意组间比较无统计学意义（.，），其中 和 基因的溶解曲线和扩增曲线良好，见表 和图 。表 细胞染氟 时 表达水平（）（）分组动物数 值 值 对照组.低氟组.（）高氟组.（）.注：（）与对照组比较，.。图 细胞染氟 时 的扩增曲线 图 细胞染氟 时 的溶解曲线 图 细胞染氟 时 基因 的扩增曲线 贵 州 医 科 大 学 学 报 卷图 细胞染氟 时 的溶解曲线 .蛋白表达检测结果染氟 ，高氟组 蛋白水平较低氟组、正常组表达升高（.，.），而总 蛋白表达水平高氟组升高较低氟组、对照组有意义（.，.）。见表 和图。染氟 后，染氟组 表达逐渐升高，各组间比较均有统计学意义（.，.），且总 蛋白表达水平也逐渐增加，染氟组较正常组有统计学意义（.，.）。见表 和图。表 细胞中、蛋白表达水平（）（）分组 细胞 蛋白 细胞 蛋白比值 对照组.低氟组.高氟组.（）（）.（）（）.对照组.低氟组.（）.（）.高氟组.（）（）.（）.注：（）与对照组比较，.；（）与低氟组相比较，.。注：、分别表示对照组、低氟组、高氟组，为相对分子质量，为，为。图 细胞染氟 时、激酶表达 注：、分别表示对照组、低氟组、高氟组，为相对分子质量，为，为。图 细胞染氟 时、激酶表达 讨论地方性氟中毒（）是由于一定地区的环境中氟元素过多，而致生活在该环境中的居民经饮水、食物和空气等途径长期摄入过量氟所引起的以氟骨症（）和氟斑牙（）为主要特征的一种慢性全身性疾病，高氟对人体神经、肌肉骨骼等系统造成慢性损害，危害较大。研究表明，慢性氟中毒动物的神经细胞存在退行性改变，而长期摄入高氟可造成过量氟在脑内储留，可能导致神经细胞发育分化异常，影响脑细胞的正常生理功能，从而引起大脑皮质及海马神经元病理改变。人体的大脑皮质枕叶区和额叶区、海马 期邱志伟等 氟暴露下 细胞 信号转导通路的改变区都是参与学习记忆和智力功能的重要结构，海马区的作用不仅仅是制造记忆，而是记忆“存储器”，已有研究表明慢性氟中毒大鼠学习记忆能力降低，其与神经细胞的改变关系密切。慢性氟中毒时 术检测表明，大脑皮层及海马神经细胞凋亡率升高，明显影响细胞周期 期（合成期），进入 期的神经元数量显著减少，可以抑制凋亡，这也是在正常情况下 的主要生理功能，实验也证明 介导了 的抗凋亡作用，的激活可抑制脑缺血损伤时的神经细胞凋亡、产生神经保护作用。研究表明，阻断 会下调细胞周期蛋白、细胞周期蛋白 和 等的表达，导致细胞周期停滞于 期和生长抑期，信号转导通路在中枢神经系统广泛表达，各种细胞外刺激信号可通过这条通路影响突触传递、神经元的重塑、形态分化等，同时 的活化对细胞增殖、分化等生理过程是必需的。有研究发现 可以被 激活，调控 介导的促凋亡蛋白 的磷酸化，增加抗凋亡蛋白 的表达，可以促进细胞生存，抑制凋亡，这也是其正常情况下的主要功能。本研究通过复制神经细胞慢性氟中毒模型，随着染氟剂量和染氟时间的延长，的基因水平未发现改变，而发现染氟组中磷酸化 的表达水平逐渐增高，而 激酶的表达水平也慢慢增加，且 的激活较明显，表明 激酶对慢性氟中毒神经细胞损伤中起到关键的代偿性作用，提示 信号通路很可能在氟中毒脑损伤过程中起到一定的抗凋亡作用。此外，自由基损伤是氟中毒神经性脑损伤中的重要机制，中枢神经系统神经元的氧化应激级联与大量的自由基释放有关，而 是氧化应激激酶，也是毒性物质通过通路，作为中间环节，与信息传递、细胞的正常功能有关。研究表明，激活与自由基密切相关，随着染氟时间延长，和 代偿性增高，参与和调节神经系统功能 ，表明 和 有可能参与了氟中毒引起的神经损伤，但 和 的激活对自由基引起的组织或细胞损伤起到保护作用，起到正向性调节代偿作用，且 的代偿作用更为及时更为主要，它们有可能是氟中毒神经细胞损伤过程中的重要参与因素，这些改变可能仅仅是过量氟导致细胞信息传递变化的部分环节。近几年关于氟中毒学习记忆力降低的报道较多，是多种属动物多种学习记忆形式的主要分子，而 信号通路在氟中毒神经细胞中被激活，虽然科学家目前对于记忆的运作机制的了解还不够，而神经细胞突触的形成也与记忆相关联（这一机制对于理解我们自身是非常重要的），信号通路参与神经突触的形成，故 信号通路很可能与维持细胞正常生理功能及学习记忆能力的关系较为密切。细胞在地方性氟中毒模型的应用中较多，本实验表明 信号通路很可能介导了慢性氟中毒神经细胞损伤的保护作用，与大脑学习记忆能力可能有重要的相关关系，信号通路在慢性氟中毒脑损伤被激活，其很可能是慢性氟中毒性神经性脑损伤机制中的重要参与因素，其与慢性氟中毒神经兴奋性毒性 的代偿性保护机制值得进一步深入研究。参考文献 黄蒙，郭洁洁 信号转导通路在神经退行性疾病中的研究进展 现代实用医学，（）：郝雪洁，张海东，孔令敏，等 的生物学特性及其相关疾病的研究进展 职业与健康，（）：，官志忠，刘艳洁，冉龙艳，等 信号转导通路改变在慢性氟中毒脑损伤机制中的作用 中国地方病学杂志，：盛晓赞，夏亚一