粗茎鳞毛蕨无菌培养基质筛选研究初报_周远航.pdf

辽 宁 林 业 科 技Liaoning Forestry Science&Technology2023年第3期2023No3收稿日期：2023-04-19基金资助：吉林省科技发展计划重点研发项目（20200402114NC）。作者简介：周远航，工程师，主要从事植物组织培养工作，E-mail：。*通讯作者：陈兴玲，正高级工程师，主要从事林木遗传育种研究，E-mail：。粗茎鳞毛蕨无菌培养基质筛选研究初报周远航，代新竹，宋平，江薇，陈兴玲*（长春市林业科学研究院，吉林 长春130000）摘要：粗茎鳞毛蕨具有极高的观赏价值和生态价值。为加强蕨类开发应用，采用开放培养基即土壤培养基（草炭土、针叶土、田园土、阔叶土、黄泥土）及传统培养基（MS、1/2MS、1/4MS）对粗茎鳞毛蕨孢子进行无菌萌发培养。结果表明：草炭土培养基的孢子最早萌发，仅需 6 d 就萌发，萌发率最高 81.43%，培养 12 d 达到片状体阶段。添加蔗糖 5 gL-1的 1/2MS 培养基孢子 15 d 萌发率最高 88.93%。该研究为实现粗茎鳞毛蕨规模化无菌生产奠定了基础。关键词：粗茎鳞毛蕨；开放培养基；传统培养基；孢子；萌发率中图分类号：S682.35文献标识码：A文章编号：1001-1714（2023）03-0021-03Preliminary study on selection of sterile culturemedium for Dryopteris crassirhizomaZHOU Yuanhang，DAI Xinzhu，SONG Ping，JIANG Wei，CHEN Xingling*（Changchun Forestry Science Research Institute，Changchun 130000，China）Abstract：Dryopteris crassirhizoma has extremely high ornamental and ecological value.In order to strengthen the development and application of ferns and enrich the species of landscape plant，the spores were cultured using open culture medium（peat soil medium，coniferous soil medium，pastoral soil medium，broad-leaved soil medium）and traditional culture medium（MS，1/2MS，1/4MS），respectively.The results showed that the spores of the peat soil mediumgerminated earliest，taking 6 days，with a maximum germination rate of 81.43%and reaching the stage of flaky bodies.The highest spore germination rate was 88.93%when sucrose 5 gL-1was added to 1/2MS medium.This study lays thefoundation for achieving large-scale aseptic production of Dryopteris crassirhizoma.Key Words：Dryopteris crassirhizoma；open culture medium；traditional culture medium；spore；germination rate粗茎鳞毛蕨 Dryopteris crassirhizoma 为 鳞毛蕨科、平鳞亚属植物，分布在我国东北和河北省东部的针阔混交林和阔叶混交林下，为多年生大型草本植物1-2，具有株形优美、色泽饱满、叶片排列错落有致、抗逆性强等特点，在园林绿化及观赏植物中应用前景广阔3-4。粗茎鳞毛蕨根茎入药，具有活血化瘀、清热解毒的作用，被我国药典收录5-6。粗茎鳞毛蕨自然繁殖能力较弱，且有逐年减少趋势7，为保护自然资源，推动粗茎鳞毛蕨在园林绿化和中药材等方面的开发应用，连永权等8对粗茎鳞毛蕨进行人工繁殖及复壮。王禾等9对粗茎鳞毛蕨孢子消毒剂处理时间、孢子离心转数等进行研究。安晓云等10对绵马鳞毛蕨培养基中激素质量浓度、无机盐浓度、光照时间等进行研究。本研究将传统土壤播种与植物组培快繁模式相结合，采用开放培养基（土壤、琼脂和水配成培养基）和传统培养基培养粗茎鳞毛蕨孢子，探讨萌发时间、萌发进程、萌发率等方面的差异，以期为实现粗茎鳞毛蕨高效繁育以及其它珍稀濒危蕨类植物的繁殖及保护提供新思路。21第 3 期2023 年辽 宁 林 业 科 技1材料与方法1 1.1 1试验材料试验材料试验材料为粗茎鳞毛蕨孢子。1 1.2 2试验方法试验方法1 1.2 2.1 1孢子粉收集孢子粉收集2021 年 7 月选择粗茎鳞毛蕨带有孢子囊的绿色叶片平铺于报纸上，自然阴干，孢子囊破裂后收集孢子粉，装入密封袋放在 4 冰箱中备用。1 1.2 2.2 2开放培养基开放培养基开放培养基为草炭土、田园土、针叶土、阔叶土、黄泥土培养基。100 g 土壤添加 6 g 琼脂溶解于1 L 水中，经 121 高温高压灭菌 20 min 后，分装于塑料培养盒中。1 1.2 2.3 3传统培养基传统培养基传统培养基为 MS、1/2MS 和 1/4MS 培养基。每个处理添加琼脂 6 gL-1，蔗糖 0、3 gL-1、5 gL-1。经 121 高温高压灭菌 20 min 后，分装于塑料培养盒中。pH 值为 5.8。1 1.2 2.4 4孢子接种孢子接种每个处理取 20 mg 孢子粉，用二氧化氯气体熏蒸消毒 15 min 后，均匀接种到不同培养基上。每种培养基接种 5 小盒，重复 3 次。1 1.2 2.5 5培养条件培养条件孢子培养条件为 14 h 光照 10 h 黑暗，光照强度为 2 000 lx，温度为 25。1 1.2 2.6 6数据分析数据分析接种后采用 XSP-2CA 型光学显微镜观察并记录孢子萌发进程，开放培养基、传统培养基分别于12 d、15 d 调查孢子萌发率。用 SPSS 17.0 软件进行方差分析。2结果与分析2 2.1 1开放培养基对孢子萌发的影响开放培养基对孢子萌发的影响2 2.1 1.1 1开放培养基对孢子萌发时间的影响开放培养基对孢子萌发时间的影响由表 1 可以看出，开放培养基对孢子萌发时间影响显著（P0.05）。表1开放培养基对粗茎鳞毛蕨萌发的影响处理12345土壤培养基草炭土针叶土田园土阔叶土黄泥土萌发时间/d6.000.82c7.250.50bc7.750.50b7.000.82ab8.750.96a萌发率/%81.432.72a72.908.49ab65.838.04b81.101.91a62.0013.11b生长状态出现片状体刚萌发出现丝状体刚萌发出现丝状体注：不同字母表示 0.05 水平差异显著。下表同。2 2.1 1.3 3开放培养基对孢子萌发进程的影响开放培养基对孢子萌发进程的影响由表 1 还可以看出，发育 12 d 时，草炭土培养基的孢子部分已进入第 3 阶段，即片状体阶段，而田园土、黄泥土培养基中孢子萌发处于第 2 阶段，即丝状体阶段，针叶土和阔叶土培养基中孢子则仍处于刚萌发阶段。2 2.2 2传统培养基对孢子萌发的影响传统培养基对孢子萌发的影响由表 2、表 3 可以看出，传统培养基对粗茎鳞毛蕨孢子萌发影响显著。1/2MS 培养基的孢子萌发率显著高于 MS、1/4MS 培养基。除 1/4MS 培养基外，在同一培养基上，蔗糖含量 35 gL-1时孢子萌发率无显著差异（P0.05），与不添加蔗糖的孢子萌发率差异显著（P0.05）。不同培养基与蔗糖含量之间可能存在交互作用，当培养基为 1/2MS、蔗糖含量为 5 gL-1时孢子萌发率为 88.93%，观察发现随时间延长该处理的原叶体生长更加健壮。表2传统培养基及蔗糖含量对孢子萌发率影响处理123456789基本培养基MSMSMS1/2MS1/2MS1/2MS1/4MS1/4MS1/4MS蔗糖含量/gL-1035035035萌发率/%20.318.91c7.230.96d0.500.30d64.474.61b83.577.72a88.933.68a27.934.65c24.677.03c30.17.29c 22第 3 期2023 年周远航等：粗茎鳞毛蕨无菌培养基质筛选研究初报表315 d萌发率主体间效应的检验源校正模型截距无机盐含量糖含量无机盐含量糖含量误差总计校正总计型平方和25124.427a40299.97523478.75723.5861622.083598.30166022.70325722.727df81224182726均方3140.55340299.97511739.37911.793405.52133.239F值94.4841212.433353.1820.35512.200Sig.0.0000.0000.0000.7060.000注：R2=0.977（调整 R2=0.966）。3结论与讨论该研究以粗茎鳞毛蕨孢子为试材，探讨开放培养基和传统培养基对孢子萌发的影响。结果表明：草炭土和阔叶土培养基的孢子萌发较早，萌发率分别为 81.43%和 81.10%；针叶土和田园土培养基的孢子萌发时间接近，黄泥土培养基的孢子萌发最晚，萌发率最低仅 62%。从发育进程看，草炭土培养基的孢子 12 d 可以达到片状体阶段，发育程度最高，因此，草炭土培养基为最适合粗茎鳞毛蕨孢子萌发的开放培养基。1/2MS 培养基（低糖）的孢子萌发率显著高于MS 培养基（低糖）和 1/4MS 培养基（低糖），这与孙晓梅等11认为 MS（糖含量 20 gL-1）培养基萌发率较高研究结果不同。观察发现 1/2MS（低糖）培养基中孢子萌发比较集中，而其他培养基孢子萌发会持续较长时间，出现萌发不齐的现象。本研究与蔡煜等12研究光叶蕨孢子在 1/2MS（糖含量 20 gL-1）培养基中萌发率高于 MS 培养基、1/4MS 培养基的萌发率结论相类似。在适中无机盐浓度中，推测1/2MS 培养基的渗透压较为适合粗茎鳞毛蕨孢子萌发需求，虽然低糖含量对孢子萌发初期萌发率无显著影响，但是随着孢子培养时间延长，蔗糖含量5 gL-1处理颜色更加浓绿。因此，传统培养基可选择 1/2MS 培养基添加 5 gL-1蔗糖来进行萌发培养。参 考 文 献：1王微.东北资源植物手册M.北京：科学出版社，1958.2刘保东，李新宏.东北经济蕨类植物资源J.中国野生植物资源，1995（4）：36-38.3石雷.观赏蕨类M.北京：中国林业出版社，2002.4石雷，李东.观赏蕨类植物M.合肥：安徽科学技术出版社，2002.5中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴M.北京：科学出版社，1995.6史志诚.中国草地重要有毒植物M.北京：中国农业出版社，1997.7王俊浩，石国良.鼎湖山药用蕨类植物资源与分布J.资源开发与市场，1995（2）：66-698连永权，王晓楠，陈真传，等.粗茎鳞毛蕨应用的研究J.中国野生植物资源，2005（4）：29-329王禾，冯玉兰，黄笛，等.粗茎鳞毛蕨孢子萌发研究J.植物研究，2012，32（3）：270-274.10安晓云，王圣杰，杨烁，等.绵马鳞毛蕨的组织培养与植株再生J.植物生理学通讯，2007（4）：739-740.11孙晓梅，李恒，孙戌男，等.北方地区3种蕨类孢子组培萌发率研究J.沈阳农业大学学报，2020，51（3）：265-270.12蔡煜，余凌帆，文智猷，等.濒危植物光叶蕨孢子离体培养与萌发研究J.四川林业科技，2016，37（6