G-MDSCs及HO-1对...性移植物抗宿主病的预测价值_陈璐.pdf

临床研究 及 对异基因造血干细胞移植后患者发生急性移植物抗宿主病的预测价值陈璐，倪明，王力，潘成云，亢倩，詹雲，赵鹏，王季石，（贵州医科大学附属医院 血液内科，贵州 贵阳；贵州医科大学 临床医学院，贵州 贵阳；苏州大学附属第一医院国家血液病临床研究中心，江苏 苏州）摘 要目的 探讨粒细胞的髓系来源抑制性细胞（）和血红素加氧酶（）对异基因造血干细胞移植（）患者发生急性移植物抗宿主病（）的预测价值。方法 收集 例 术患者的一般临床资料，据 年西雅图分级标准判断 发生情况分为有 组和无 组，抽取 组患者移植后第、周及第 月时全血，运用多色流式细胞术（）检测患者外周血 及胞内 和白细胞介素（）的水平，采用表面抗原染色检测 的百分比和绝对值计数，采用破膜染色检测 中 和 的中位荧光强度（）、表达百分比及绝对值计数。结果 组患者 后第 周于外周血中均可检测到，但第 周时有 组患者外周血 较无 组升高（.）；破膜染色结果显示，有 组患者于 后第 周时 内 高于无 组（.）。结论 患者术后第 周外周血中 和 的高表达可预测 的发生。关键词血红素加氧酶；白细胞介素；粒细胞的髓系来源抑制性细胞；异基因造血干细胞移植；急性移植物抗宿主病；新鲜外周血中图分类号.文献标识码 文章编号（）：，（，；，；，）（）（）（）（），：，第 卷 第 期 年 月 贵 州 医 科 大 学 学 报 基金项目国家自然科学基金（，）；贵州省科学技术基金项目（黔科合基础 一般）贵州医科大学 级硕士研究生通信作者：引用本文：陈璐，倪明，王力，等 及 对异基因造血干细胞移植后患者发生急性移植物抗宿主病的预测价值 贵州医科大学学报，（）：（），（），（）（）；目前，异基因造血干细胞移植（，）仍是多种常规疗法无法治愈的血液系统疾病的唯一有效选择。后可发生多种并发症，其中移 植 物 抗 宿 主 病（，）发生率高，严重影响患者生存质量，甚至导致患者死亡。如今，以细胞治疗为基础的抗急性（，）疗法已取得了一定的进 展，调 节 性 细 胞（，）、免疫耐受性树突状细胞（，）及间充质干细胞（，）均在 动物模型或期临床实验中展示出一定的疗效。髓系来源的抑制性细胞（，）是病理激活的中性粒细胞和单核细胞，该群细胞具有强大的免疫抑制活性，在加速肿瘤进展和破坏抗癌治疗效果方面发挥着重要作用。虽然已经观察到人类 与 之间的临床相关性，但无实际数据可以确定人 是否可在体内预防和 或控制。血红素加氧酶（，）属于应激蛋白家族，可对缺氧、细胞因子等刺激作出反应，并诱导免疫耐受。本课题组前期研究结果显示，患者的 表达明显低于未发生 患者，提示氧化应激分子 可能有助于控制 。然而，如何降低患者 的发生风险目前尚不清楚，因此本研究拟通过分析 后病人不同时间点的新鲜外周血、探讨粒细胞的（，）及胞内、白细胞介素（，）等细胞因子对 发病的预测作用。材料与方法.实验材料.样本来源及分组选取 年 月 年 月 术后患者 例，要求符合初次确诊、术前接受清髓治疗及预计生存时间大于 个月，排除行自体造血干细胞移植（，）术患者及传染性疾病（如乙肝、梅毒、艾滋病等）患者。取新鲜外周血（未过夜）作为标本来源。本研究已根据赫尔辛基宣言获得了病人以及供者的知情同意。.主要试剂及仪器 抗分化簇 抗体（，）、抗人类白细胞抗原 抗体（，）、抗分化簇 抗体（，）及（）抗体（美国 公司），抗分化簇 抗体（，）、红细胞裂解液及细胞破膜液均为美国 公司），抗（）抗体（英国 公司），流式细胞计数微球（美国 公司），牛血清白蛋白（，；北京索莱宝科技有限公司），磷酸盐缓冲液（，；中国兰杰柯科技有限公司）；流式试管（墨西哥 公司），流式细胞仪（，美国 公司），牛血清白蛋白（，；北京索莱宝科技有限公司。期陈璐等 及 对异基因造血干细胞移植后患者发生急性移植物抗宿主病的预测价值.实验方法.一般临床资料及 的诊断收集患者性别、年龄、疾病诊断急性髓系白血病（，）、急性淋巴细胞白血病（，）、骨髓增生异常综合征（，）、再生障碍性贫血（，）及非霍奇金淋巴瘤（，）、术前预处理方案白消安 环 磷 酰 胺（，）、抗胸腺细胞球蛋白（，）、阿扎胞苷（，）、伊达比星（，）、美法仑（，）、依托泊苷（，）、氟尿嘧啶（，）、环磷酰胺（，）、环孢霉素（，）及霉酚酸酯（，）、排异预防、感染及复发情况等一般资料；结合患者移植治疗过程中临时与长期医嘱以及对应病程，参照 年西雅图分级标准判断患者是否发生 及其程度。.血标本抽取 抽取病例组患者移植完成后第、周及第 个月等 个时间点的空腹新鲜外周血。.全血活细胞中 表面抗原染色取“.”项下新鲜外周血加入 试管中，加含有 的 ，离心 ，重复操作洗涤细胞 遍；取出，吸取上层悬液，含有 的 重悬细胞，同步细胞表面抗原封闭；避光，往 内加 表面标记抗体、各，避光孵育 ；抗体孵育结束，加 洗涤上述细胞 次，离心时间、转速、温度等条件同前。采用 流式上机检测 的百分比和绝对值计数。.与 的表达取“.”项下新鲜外周血，采用破膜染色检测 中氧化应激蛋白 及经典免疫抑制因子 的表达，使用荧光减一对照（，）确保染色的可靠性，即在对照管中加入除 及 之外的其他抗体作为染色对照组。.膜内抗原、破膜染色取“.”项下表面抗原染色完毕后细胞，往 中加稀释后的 （）裂解，避光 ；离心 ，收获细胞，洗涤细胞；中加 稀 释 后 的 （）破膜，置于暗环境 ；离心，收获细胞，洗涤细胞；往收获的细胞中加 重悬细胞，室温避光 ；加 膜内标记抗体 和 各 ，避光孵育 ，同时开启 备用；抗体孵育结束，将装有 的试剂瓶置于 旋涡混合器上振荡 ，吸取 于 中用于计算各细胞群体绝对值数目；加 或.氯化钠注射液 后上机检测得中位荧光强度（，）、表达百分比及绝对值计数等。.流式数据分析取“.”项下表面抗原染色及破膜染色完毕的细胞，采用 .（美国 公司）软件进行流式数据分析，详细分析策略见图。首先圈选活细胞，随后对其表型进行分析，寻找；通过圈选绝对值计数微球对 进行计数。注：（）表示 ，（）表示活细胞群体；后流式框选在（）基础上展开。图 、及 流式分析策略 ，贵 州 医 科 大 学 学 报 卷.统计学分析利用 .统计学软件进行数据分析。计数资料以 （）表示，数据比较采用 检验；运用 秩和检验及两独立样本 检验比较计量资料；以 .为差异有统计学意义。结果.临床特征 术后患者分为有 组（）和无 组（），组患者性别、年龄、疾病诊断类型、是否外周血来源、预处理方案、预防方案、是否发生感染及复发等一般临床资料，差异无统计学意义（.，表）。患者术后发生 的平均天数为.（，），分度、及 分别为、及例，累及皮肤、胃肠道、肝脏及未知部位分别为、及 例。.水平 组患者 后第 周于外周血中检测到，且在第 周时有 组病人 的百分比及绝对值计数均高于无 组，差异有统计学意义（.，图）。表 有 组和无 组 术后患者的临床特征 临床特征有无置信区间性别 男（）（）（）.女（）（）（）年龄（，），岁（，）.（，）.疾病诊断（）（）（）.（）（）（）.（）（）（）.（）（）（）.（）（）（）.外周血液来源（）（）（）.预处理方案 改良 （）（）（）.改良 （）（）（）.改良 （）（）（）.改良 （）（）（）.改良 （）（）（）.改良 （）（）（）.（）（）（）.（）（）（）.改良 （）（）（）.改良 （）（）（）.改良 （）（）（）.（）（）（）.预防方案 ，（）（）（）.感染（）（）（）.复发（）（）（）.期陈璐等 及 对异基因造血干细胞移植后患者发生急性移植物抗宿主病的预测价值注：为百分比，为绝对值计数；（）与无 组比较，.。图 有 组和无 组 术后患者不同时间点 的水平 .和 的表达结果显示，及 对照管表达均在 附近，但 组实验管峰值较对照管明显右移（范围），组实验管峰大约位于 且较对照管右移。见图。.表达的百分比、及绝对值计数在 后第 周时有 组病人 中 表达的百分比、及绝对值计数均高于无 组，其差异均有统计学意义（.）。见图。图 术后患者 中 与 的表达（染色）（）贵 州 医 科 大 学 学 报 卷注：为表达百分比，为，为绝对值计数；（）与无 组比较，.。图 有 组和无 组 术后患者不同时间点 中 的水平 讨论 是 后典型且严重并发症，其发病机制至今仍不明确。以往研究认为，人类白细胞抗原（，）不合引起的同种异体反应性 细胞激活及随后造成的靶器官损伤是 的主要病理生理过程，在同胞全相合异基因移植中 发生率为 ，而在无关供体异基因移植中发生率高达；发生重度 的约占无关供体移植患者的，重度 患者 年存活率不到。因此，对 患者进行 的预防及治疗是提高患者长期生存率及改善生存质量的关键。是一类维持机体稳态的细胞群体，正常人体内均有存在。当机体在处于应激及出现炎症反应等病理状态时，体内免疫细胞被激活，此时 比例增多以控制自身过度反应的免疫状态。目前，不论是在肿瘤的免疫逃逸研究领域，还是在 背景下的免疫耐受，都是科学研究之热点。为从多层面探讨 可能在 发生发展中参与的作用，在移植后不同时间点对患者的外周血进行免疫监测时加入了 的绝对数，从而使得数据不仅仅有描述细胞间相对数量关系的百分比，也可以凭借绝对数描述患者外周血中 的数量。结果显示，患者 水平高于正常人，随着时间的延长逐渐下降，印证了移植后早期免疫重建中大量不成熟粒细胞中有较多 的猜想，这也提示了 在移植后早期患者中的表达具有一定的异质性。等报道了在异基因骨髓移植受者小鼠模型中，移植后 的比例明显升高，随后会逐渐下降至未行骨髓移植的对照组水平；也有研究显示，后第 天时拥有高百分比（.）和高绝对数（.）的患者随后发生 的风险较高，提示高水平的 可能对 发生 期陈璐等 及 对异基因造血干细胞移植后患者发生急性移植物抗宿主病的预测价值有预测作用；林毓等利用小鼠建立不同严重程度的 模型，发现移植后 周各组小鼠外周血及脾脏中 及各亚群的比例均处于较高水平，但移植后 周无 组小鼠外周血和脾脏 及 其 各 亚 群 水 平 下 降，轻 度 及 中 重 度 组小鼠 比例仍保持在较高水平，脾脏 比例与 的严重程度呈正相关，中重度组比例较轻度组更高，表明了小鼠异基因骨髓移植后 可诱导脾脏 的聚集，且与 严重程度呈正相关。这与本实验结果有一致之处。因此，有理由认为 术后随着患者免疫重建的进行，其机体内各免疫细胞逐渐趋于成熟，表达百分率逐渐降低；但发生 后 的表达量明显升高。因此，后 的延迟降低可能标志着患者体内存在尚无明显临床症状的炎症，因而有较高发生 的风险。是一种氧化应激标志物，已有研究表明其在诱导由细胞中活性氧（，）积累引发的氧化应激反应通路相关基因表达中起作用。为进一步深入分析 的变化与机体炎症反应间的关联性，本研究对 后患者不同时间点外周血标本中 进行了破膜染色，观察其胞内 的表达情况。结果显示，有 组 后患者 中 的表达百分比、绝对数及 均高于无 组患者，提示尽管此时患者无明显 症状，但其体内的氧化应激反应已处于较高水平，免疫系统处于较强的激活状态，因此有较高 发生风险。是一类经典的并具有抗炎特性的细胞因子，在预防炎症及病态自身免疫中起到重要作用；可通过限制机体对病原体的免疫应答，进而防止宿主受到损伤，在感染中发挥核心作用；也是 发挥免疫抑制作用的机制之一。然而，在 后患者外周血 中并未观察到 的大量表达，其原因还需后续行转录组测序等来进一步探明。综上所述，本研究描述了 在 后患者 月内的变化趋势，并对移植后早期 的免疫重建过程这一新兴研究领域进行了探讨，结果表明 及 可能是 后患者 发生的预警标志，同时也可以反映患者体内的炎症水平。参考文献 ，：，（）：，：，（）：，：，：，：，（）：，：，（）：，（）（），（）：，：，（）：，：，（）：贵 州 医 科 大 学 学 报 卷 ，（）：，：，（），（）：陈文明，黄晓军 血液病学 北京：科学出版社，：，（）：，（）：，（）：林毓 雷帕霉素调控髓系来源抑制性细胞（）在急性移植物抗宿主病中的作用及机制研究 杭州：浙江大学，（）：，：，（）：，（），：，（）：，