基于乙酰半胱氨酸修饰的铂纳...拟生物氧化酶活性及检测应用_林晓昀.pdf

基于乙酰半胱氨酸修饰的铂纳米粒子模拟生物氧化酶活性及检测应用林晓昀（福建省立医院，福建 福州 ）摘要目的：开发一种易于制备、具有良好生物氧化酶活性的铂纳米粒子探针，用于快速、选择性地检测。方法：利用硼氢化钠对氯铂酸进行还原后，快速加入乙酰半胱氨酸（）对其进行修饰，形成超小粒径的铂纳米粒子（）。采用透射电子显微镜（）、射线光电子能谱（）、红外光谱和 电位仪对乙酰半胱氨酸修饰的铂纳米粒子（）的大小和形态、表面元素、表面基团以及带电荷情况进行了表征。利用，四甲基联苯胺（）对 的模拟生物酶活性进行了探索。通过 对 的聚集抑制作用，将 的含量与 的氧化酶活性联系起来，从而检测 的含量。结果：平均粒径为 的 具有良好的稳定性和模拟生物氧化酶活性，的检测线性范围 至 ，检测限为 。结论：超小粒径的 制备简单，且具有高稳定性、强氧化酶活性的特点。利用 与 的相互作用，实现了对 的选择性地检测。关键词铂纳米粒子；模拟生物氧化酶；检测 中图分类号：文献标识码：文章编号：（）（，）：，（）（），（）（），（），（），：，：；北方药学 年第 卷第期天然酶具有较高的底物特异性和高效性，在各个领域得到广泛的研究和应用。然而，由于天然酶易变性、易被蛋白酶消化、成本高、储存要求高等固有特性，使其应用受到限制。因此，开发新型的人工模拟酶是很有必要的。铂纳米粒子具有低成本可控合成、在严格条件下的高稳定性和催化活性可调的特性，在环境检测和生物医学方面具有潜在的价值。铂纳米粒子模拟氧化酶与模拟过氧化物酶不同，它可以在没有 的情况下催化有机底物氧化，这种催化过程避免了生物破坏性的的参与，使铂纳米粒子具有良好生物相容性。汞是最危险的金属污染物之一，会损害各种器官和免疫系统。传统的 检测方法往往需要 昂贵、耗 时、复杂的设 备。针对这些缺点，比色检测方法的应用简单而灵敏。此外，它不需要复杂的仪器，可以“肉眼”检测结果。因此，利用铂纳米粒子，实现对 的快速检测具有重要意义。材料和方法 实验仪器与试剂 主要实验仪器 紫外可见分光光度计（日本岛津公司）、型快速混匀器（江苏金坛医药仪器厂）、数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）。主要试剂六水合氯铂酸 阿拉丁（上海）有限公司、硼氢化钠（国药集团化学试剂有限公司）、乙酰半胱氨酸（国药集团化学试剂有限公司）、，四甲基联苯胺 阿拉丁（上海）有限公司。实验方法 的制备将氯铂酸溶液（，）加入到 超纯水中，在强烈搅拌下将硼氢化钠（，）添加到氯铂酸溶液中还原 形成铂纳米粒子。秒后，将 （，）添加到上述混合物中，并将混合物在室温下搅拌 分钟以确保 与铂纳米粒子充分反应，形成 。的检测在 中加入 不同浓度的，充分反应分钟后，依次加入 醋酸缓冲液 和 （），在 恒温水浴中反应 分钟后，在紫外光谱 波长下测定混合溶液的吸光度。结果 的表征 的大 小 和 形 态 通 过 进 行 表图 表证征。如图 显示，为均匀分散的纳米晶体，形状接近球形，其晶格间距 ，的平均直径为（）。通过 探究北方药学 年第 卷第期 的元素组成。图 显示在 光谱中，、和 的原子百分比分别为 、和 ，表明铂纳米粒子表面存在、，与 乙酰半胱氨酸的元素组成一致。此外，图 显示 的 的结合能为 和 ，表明铂以 和 的形式存在。图 通过红外光谱表明铂表面的主要基团有 振动峰处的，处的以及 处的 ，与 的基团组成一致。的 电位为（），表明其具有较强的负电荷，能够在溶液中稳定存在。的模拟氧化酶活性为了探索 的氧化酶活性，通过在没有 的情况下催化底物的氧化来进行实验。如图 显示，催化下的 呈现蓝色，在 处显示出明显的吸收峰（曲线），而在没有 催化的情况下没有明显的现象（曲线）。为了探究 模拟氧化酶的机理，通过用氮气吹扫反应溶液 分钟去除溶液中的氧气，结果如图 柱所示，催化的氧化的反应速率迅速降低（图 柱为空白对照），表明在没有的情况下溶解的参与了氧化过程。叔丁醇（）和超氧化物歧化酶（）分别为和的清除剂。图 柱和柱 显 示 在 反 应 液 中 加 入 或 ，的催化活性几乎没有变化，而添加 和 时分别下降了 和（图 柱和柱），表明在 催化氧化反应中产生自由基，无 自由基生成。基于这些实验结果，我们提出了 催化 氧化的机制：可以将溶液中的氧气（）催化成，然后 被氧化成 ，形成蓝色产物。的氧化酶活性源于它们对氧还原的催化能力，其反应途径可以用以下方程式来描述：为了更好地了解 的催化过程，通过改变 的浓度来确认催化反应的表观稳态动力学参数。如图 所示，反应速度随着 浓度的不同而变化。这些数据符合 方程。动力学采用方程形式为 （）。米氏常数（）是反应速率为最大速度（）一半时的底物浓度，可以反映酶对底物的亲和力。结果显示米氏常数（）和最大速度（）分别为 和 。表明 与 之间具有良好的亲和力。图 的模拟氧化活性 反应条件优化、时间和温度三个参数对 氧化催化活性的影响如图所示。显示出 依赖性北方药学 年第 卷第期催化活性。当 值超过 时，催化活性明显下降。这是由于 具有二胺结构，导致在弱碱介质中溶解度差。根据优化结果，、和 是 催化 的最佳催化条件。图 的、时间、温度 的检测众所 周知，易与 半胱 氨 酸等硫 醇 相 互 作用，因此，检测 的原理是将 和 的氧化酶活性联系起来，在 溶液中加入 后，可以作为 的交联剂，诱导 的聚集，从而使 的氧化酶活性降低。结果如图 所示，当加入 离子时，处的紫外吸收光谱由曲线降为曲线（曲线为空白对照），溶液的颜色从深蓝色变为浅蓝色。另外通过 可以观察到添加 后的三维 聚集体（）。图 的检测此外，我们尝试使用这种方法来检测其他离子。图 表明只有 离子可以显著抑制 的氧化酶活性，而其他离子，即使在高浓度下也没有明 显 的 抑 制 作 用。结 果 表 明，对北方药学 年第 卷第期 具有 高 选 择 性，这 是 因 为 与 其 他 离 子 相 比，配合物具有更高的稳定性常数。在最佳反应条件下，在反应体系中加入不同浓度的 ，确定了检测 的线性范围为 至 ，相关系数为 ，检测限为 （图）。我们还评估了这种方法检测饮用水中 的可行性。通过在自来水中加入汞离子标准溶液来检测加标物的回收率，如表所示，测试了三组不同浓度的 离子，回收率均在 。表自来水 加标回收实验 （）（）（）（）结论综上所述，本文制备了具有模拟氧化酶活性的 ，探究了 的催化机制，并基于 开发了一种简便、环保的 检测方法。结果表明，可以被快速准确地检测到，并且对其他金属离子具有较高的灵敏度和选择性。与其他现有的 分析方法相比，这种新的比色法具有较高的选择性，并且可以在室温下使用肉眼或普通的紫外可见分光光度计轻松完成，具有较高的使用价值。参考文献 ，（），（）：，（）：，：，（）：，：，：，（）：，（），（）：，（）：基金项目：福建医科大学启航基金项目（：）。作者简介：林晓昀（），女，汉族，福建龙岩人，硕士，药师，研究方向：生物纳米材料的制备及应用。（上接第页）方焱，方策，孟祥晖，等 基于羟基甲氨蝶呤血药浓度监测的大剂量化疗骨肉瘤患者肝功能损伤 预 测 模 型 构 建 中 国 医 院 药 学 杂 志，（）：，（）：董婧，李婷婷，邱志霞，等 比阿培南与甲氨蝶呤、呋塞米在大鼠体内的药代动力学相互作用中国医药导报，（）：董维冲，赵晓晓，张学琴，等 法测定人血浆中甲氨蝶呤的浓度中国临床药理学杂志，（）：作者简介：谢亦娴（），女，汉族，福建仙游人，大专，副主任技师，研究方向：临床医学检验临床基础检验技术。北方药学 年第 卷第期