组织工程医疗产品 用以评价软骨形成的硫酸糖胺聚糖(sGAG)的定量检测 YYT 1810-2022.pdf

YY/T1810-20223.6木瓜蛋白酶papain用于消化不同组织细胞外基质的半胱氨酸蛋白酶。来源：酶学委员会(EC)编号3.4.22.23.71,9-二甲基亚甲基蓝1,9-dimethylmethelene blue一种能与多种sGAG(3.2)特异性结合的且吸光度与所结合sGAG的含量呈线性关系的染料。3.86-硫酸软骨素chondroitin6-sulfate一种硫酸化的糖胺聚糖(sGAG),是软骨和结缔组织的重要组成成分。4概述和原理由于sGAG是天然软骨的细胞外基质主要成分之一，因此在评价组织工程构建物的软骨形成时sGAG含量是首选的检测指标。使用酶消化测试样品，使GAG释放到消化液中，并与能和sGAG结合的染料臀育后测定吸光度，根据标淮曲线换算成消化液中sGAG浓度，然后用测试样品的质量（湿重或干重）或DNA含量进行归一化计算，可测定单位质量或DNA含量样品中的sGAG含量。本文件中的方法可用于检测组织工程软骨的sGAG含量，可提供标准曲线3g/mL100g/mL的动态测量范围。本文件选用了广泛应用于sGAG定量检测的1,9-二甲基亚甲基蓝(DMMB)染料，用于sGAG定量检测。sGAG定量检测包括以下步骤：a)预处理；b)sGAG的提取（释放到消化液中）：c)DMMB实验期定sGAG含量：d)sGAG含量的归一化计算。为了实现准确的定量，应注意如质量和休积的称量取样、移液管的操作和标准曲线的绘制等关键步骤。在检则过程中，除另有说明外，仅使用公认的分析级蒸馏水或同等纯度水（见附录A)。附录B对sGAG测量的报告格式进行了举例说明。5试剂、仪器和器材5.1试剂本实验使用的试剂见附录A,5.2仪器和器材本实验使用的仪器和器材包括：a)超净工作台：b)灭菌器，例如高压灭菌锅：c)倒置显微镜：d)细胞培养箱，5%浓度二氧化碳，温度37，具有一定湿度的培养环境：