禽霍乱(禽巴氏杆菌病)诊断技术 NYT 563-2002.pdf

NY/T563-2002依据病原分离培养特性、生化鉴定、动物接种试验可作出确切诊断。5琼脂扩散试验（用于监测免疫效果和追湖性诊断）5.1材料准备5.1.1禽霜乱琼脂扩散抗原、标准阳性血清和标准阴性血清，按说明书使用。5.1.2溶液配制：1%疏柳汞溶液、pH6.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲(PBS)溶液和生理盐水，配制方法见附录B。5.1.3琼脂板的制备：取pH6.4的0.01mol/LPBS溶液100mL放于三角瓶中，加入0.8g1.0g琼脂糖，8g氯化钠。三角瓶在水浴中煮沸使琼脂糖等熔化，再加1%硫柳汞1mL冷至45C50C时，将洁净干热灭菌直径为90mm的平皿置于平台上，每个平皿加入18mL20mL。加盖待凝固后，把平皿倒置以防水分蒸发，放普通冰箱中保存备用（时间不超过2周）。5.2操作方法5.2.1打孔在制备的琼脂板上，用直径4mm的打孔器按六角形图案打孔，或用梅花形打孔器打孔。中心孔与外周孔距离为3m。将孔中的琼脂用8号针头斜面向上从右侧边缘插人，轻轻向左侧方向将琼脂挑出，勿伤边缘，避免琼脂层脱离平皿底部。5.2.2封底用酒精灯轻烤平皿底部到琼脂微熔化为止，封闭孔的底部，以防侧漏。5.2.3加样用微量移液器吸取用灭菌生理盐水（见第B.3章）稀释的抗原悬液滴入中间孔，标准阳性血清分别加人外周的1、4孔中，标准阴性血清（每批样品仅做一次）和受检血清按顺序分别加入外周的2、3、5、6孔中。每孔均以加满不溢出为度，每加一个样品应换一个吸头。5.2.4感作加样完毕后，静止5min10min,将平皿轻轻倒置，放人湿盒内置37C温箱中反应，分别在24h和48h观察结果。5.3结果判定5.3.1判定方法将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，标准阳性血清与抗原孔之间出现一条清晰的白色沉淀线，标准阴性血清与抗原孔之间不出沉淀线，则试验可成立。5.3.2判定标准5.3.2.1若被检血清孔与中心孔之间出现清晰沉淀线，并与阳性血清孔与中心孔之间沉淀线的末端相吻合，则被检血清判为阳性。5.3.2.2若被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线，但阳性血清孔与中心孔之间的沉淀线一端在被检血清孔处向抗原孔方向弯曲，则此孔的被检样品判为弱阳性，应重复试验，如仍为可疑，则判为阳性。5.3.2.3若被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线，阳性血清孔与中心孔之间的沉淀线直向被检血清孔，则被检血清判为阴性。5.3.2.4若被检血清孔与中心抗原孔之间沉淀线粗而混浊和标准阳性血清孔与中心孔之间的沉淀线交叉并直伸，待检血清孔为非特异性反应，应重复试验，若仍出现非特异性反应则判为阴性，判阳性者视为禽体内存在禽霍乱抗体。3