猪肺炎支原体检验方法 SBT 10463-2008.pdf

SB/T10463-20085培养基和试剂5.1姬姆萨氏染色液（见附录A)。5.2瑞氏染色按GB/T4789.28一2003中2.6的方法进行。5.3伊红美蓝染色（见附录A)。5.4 Goodwin氏等复合液体培养基（见附录A)。5.5 Goodwin氏等复合固体培养基（见附录A)。5.6Hanks液（见附录A)。6检验程序病理组织病理学检查分高培养肉眼检查细组织触片、液体培养固体培养织病变姬姆萨氏染色结果判断显微镜观察矩姆萨氏染色结果判断显微镜观黎结果判断图1猪肺炎支原体检验程序7检验用病料肺脏、肺门淋巴结。8检验步骤8.1病理学检查8.1.1肉眼检查肺的病变部位主要见于心叶、尖叶、中间叶及丽叶的前缘。常呈间质性肺炎病变，两侧肺病变大致对称。病变部界限明显，质地坚实，呈胶样浸润半透明状态。切面湿润、平滑，像嫩肉样（即“肉变”）。严重的病例病变部颜色加深，呈淡紫红色、深紫色或灰白色、灰红色，至后期半透明状态减轻，坚韧度增加，似胰脏组织（即“胰变”），肺门和纵膈淋巴结肿大，呈灰白色、水肿。切面湿润稍外翻，边缘有时可见轻度充血。8.1.2触片及染色检验样品制成触片，自然干燥，用甲醇固定2mn5min,再以pH7,2的磷酸盐缓冲液稀释20倍的姬姻萨氏染色液染色3，水洗后立即用丙酮浸染一次，然后镜检。2SB/T10463-20088.1.3镜检猪肺炎支原体呈紫红色，多数在细胞外，偶见在嗜中性白细胞的胞浆内。呈球状、环状、椭圆形或两极形、直杆或弯杆状，单个或群集。8.2分离培养8.2.1分离将病肺组织用Hanks液洗去血液和组织碎片，取病肺25g加入到225 mL Goodwin等氏复合液体培养基中，用均质器8000r/min10000r/min均质1min,或用乳钵加灭菌砂磨碎。用灭菌过滤器过滤，去除杂质。8.2.2培养移取10mL滤液转种于100 mL Goodwin等氏复合液体培养基中，置厌氧罐（或厌氧培养箱）中37C土1C、含5%一10%C02条件下，培养3d一7d,观察其产酸和浊度情况，培养基由红变黄，呈轻微混浊。取培养液划线接种于Goodwi等氏固体培养基平板，置厌氧罐（或厌氧培养箱）中37C士1C,培养，在固体培养基上生长缓慢，接种培养？d10d,观察可见圆形隆起，边缘整齐，表面粗糙，中央有颗粒的针尖大小或露珠状小菌落。8.2.3染色8.2.3.1取液体培养物涂片，自然干燥后火焰固定，姬姆萨氏染色。8.2.3.2取固体培养物涂片，自然干燥后火焰固定，姬姆萨氏染色。8.2.4镜检8.2.5结果判定镜下所见：因本菌无细胞壁，为多形态微生物，有环状、丝状、点状、杆状和两极状等。液体培养物涂片，菌体为蓝色、两极浓染的短杆状或逗点状，轮廓清晰。固体培养物涂片，菌体为多形性、环状等等，即可判定为猪肺炎支原体菌体。