孩儿参多糖对小鼠特异性皮炎的修复作用_刘晓英.pdf

湖南农业大学学报(自然科学版)2023，49(3)：366370DOI：10.13331/ki.jhau.2023.03.016Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)引用格式：刘晓英，韩萍，太美灵，朱溶滔，杜志云孩儿参多糖对小鼠特异性皮炎的修复作用J湖南农业大学学报(自然科学版)，2023，49(3)：366370LIU X Y，HAN P，TAI M L，ZHU R T，DU Z Y Improvement effects of Pseudostellaria heterophylla(Miq.)Pax.polysaccharide on atopic dermatitis miceJJournal of HunanAgricultural University(Natural Sciences)，2023，49(3)：366370投稿网址：http:/孩儿参多糖对小鼠特异性皮炎的修复作用 刘晓英1，韩萍3，太美灵1，朱溶滔2，杜志云2*(1.无限极(中国)有限公司，广东 江门 529000；2.广东工业大学生物医药学院，广东 广州 510006；3.佛山市康伲爱伦生物技术有限公司，广东 佛山 528200)摘要：采用脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞 RAW264.7 模型检测孩儿参多糖调控 NO 水平；构建 2,4二硝基氟苯诱导的小鼠特异性皮炎模型，检测小鼠的皮损情况、组织病理变化及皮肤组织中丝聚蛋白(FLG)、紧密连接蛋白(CLDN1)、白介素4(IL4)、白介素13(IL13)和干扰素(INF)的含量，探讨孩儿参多糖对小鼠特异性皮炎的改善作用及调控机制。结果显示：制备的孩儿参多糖可显著抑制 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞分泌 NO；外用给予孩儿参多糖处理后，特异性皮炎小鼠的皮损症状明显改善，经皮失水率降低，表皮增生现象减轻，FLG 和 CLDN1含量增加，炎症因子 IL4、IL13 和 INF的表达水平降低。可见，孩儿参多糖可改善皮肤屏障和降低炎症因子分泌，发挥修复小鼠特异性皮炎的作用。关键词：小鼠；特异性皮炎；孩儿参多糖；免疫调控；皮肤屏障；炎症因子中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1007-1032(2023)03-0366-05Improvement effects of Pseudostellaria heterophylla(Miq.)Pax.polysaccharide on atopic dermatitis miceLIU Xiaoying1，HAN Ping3，TAI Meiling1，ZHU Rongtao2，DU Zhiyun2*(1.Infinitus(China)Company Ltd,Jiangmen,Guangdong 529000,China;2.School of Biomedical and PharmaceuticalSciences,Guangdong University of Technology,Guangzhou,Guangdong 510006,China;3.Allan Conney BiotechnologyCompany Ltd,Foshan,Guangdong 528200,China)Abstract:In this study,with an aim to understand the improvement effect and regulatory mechanism of Pseudostellariaheterophylla(Miq.)Pax.polysaccharides on atopic dermatitis mice,the NO levels regulated by P.heterophyllapolysaccharides was detected using a macrophage RAW264.7 model induced by LPS,and the atopic dermatitis model inmice was constructed by 2,4-dinitrofluorobenzene and the skin lesions,pathological changes were collected and thecontent of filaggrin(FLG),claudin-1(CLDN1),interleukin-4(IL-4),interleukin-13(IL-13)and interferon-(INF-)in skintissue was measured using ELISA method.According to the results,P.heterophylla polysaccharide prepared in this studycould significantly inhibit NO secretion in RAW264.7 cells induced by LPS.Under external treatment with P.heterophylla polysaccharide,the DNFB-induced atopic dermatitis skin symptoms of mice was alleviated,both the rate oftransdermal water loss and the thickness of the epidermal layer were reduced,meanwhile,the contents of FLG andCLDN1 proteins were increased and the inflammatory factors IL-4,IL-13 and INF-were inhibited.It could beconcluded that P.heterophylla polysaccharides could improve the skin barrier and reduce the secretion of inflammatorycytokines,playing a significant role in repairing atopic dermatitis in mice.收稿日期：20211129修回日期：20230606基金项目：国家自然科学基金项目(21272043)作者简介：刘晓英(1977)，女，广东广州人，硕士，主要从事活性物护肤应用研究，Cindy.Liuinfinitus-；*通信作者，杜志云，博士，教授，主要从事药食同源物活性成分调控机制研究，第 49 卷第 3 期刘晓英等孩儿参多糖对小鼠特异性皮炎的修复作用367Keywords:mice;atopic dermatitis;Pseudostellaria heterophylla(Miq.)Pax.polysaccharide;immune modulation;skinbarrier;inflammatory cytokines特异性皮炎(AD)是一种多发于儿童人群的具有遗传倾向的皮肤疾病，伴有剧烈的瘙痒和反复发作的特征，严重影响病人和家属的生活质量。研究1发现，外因导致的皮肤屏障功能破坏会引起淋巴细胞的免疫反应，诱导AD的产生或加重。AD发病过程中，Th2型细胞因子白介素4(IL4)和白介素13(IL13)显著升高2；AD慢性皮损以Th1型细胞因子反应为主，常伴有高水平的干扰素(INF)产生3。皮肤屏障相关的丝聚蛋白(FLG)和紧密连接蛋白(CLDN1)在AD发病过程中的表达明显减少，并且IL4和IL13参与调控FLG的表达，皮肤屏障调控与细胞因子相互影响，增加了AD治疗的难度4。临床上长期使用激素类药物治疗AD，具有一定的副作用，开发具有修复皮肤屏障且能抑制皮肤炎症的活性物是治疗AD的新策略。植物多糖是传统的保湿活性物。研究56发现，植物多糖可有效减缓2,4二硝基氟苯(DNFB)诱导的AD小鼠的症状，显示天然活性多糖具有改善AD的功效。孩儿参(Pseudostellaria heterophylla(Miq.)Pax)为石竹科孩儿参属植物，又名太子参，具有生津润肺、益气健脾的功效。现代药学研究发现，孩儿参含有多糖类、挥发油类、皂苷类、环肽类、甾醇类和氨基酸等活性成分7。多糖是孩儿参的主要活性成分之一，具有抗氧化、降血糖、增强免疫等药理活性78，可修复因环磷酰胺引起的肠道黏膜损伤9，可用于治疗糖尿病足10，显示孩儿参多糖在皮肤和黏膜的修复方面具有潜在的治疗效果。基于此，笔者通过 DNFB 诱导建立小鼠 AD 模型，研究孩儿参多糖对小鼠 AD 的改善作用，旨在为孩儿参在临床皮肤科用药和日常护理产品中的应用等方面提供依据。1材料与方法1.1供试材料40 只 68 周龄的 SPF 级 Babl/c 雌性小鼠购自广东医学院实验动物中心。动物生产许可证为SCXX(粤)2018002。按照常规方式进行饲养。孩儿参购自北京同仁堂药店；2,4二硝基氟苯(DNFB)购自无锡市展望化工试剂有限公司；丝聚蛋白(FLG)、紧密连接蛋白(CLDN1)、白细胞介素4(IL4)、白细胞介素13(IL13)和干扰素(INF)试剂盒均购自江苏酶标生物科技有限公司。1.2孩儿参多糖的制备及其抑制小鼠 RAW264.7细胞活性与 NO 分泌的测试参照文献11的方法，提取、制备孩儿参粗多糖，并测得样品中粗多糖质量分数为27.89%。参照文献12的方法，设置添加0、5、25、125、250、500、1000 g/mL的孩儿参多糖的7种处理，采用MTT法检测孩儿参多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7活性的抑制作用；设置添加0(模型组)、2、10、50、250、500 g/mL的孩儿参多糖和1 g/mL的LPS的6种处理及两者都不加的空白组，检测孩儿参多糖对LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌NO的抑制作用。1.3试验设计将40只供试小鼠随机均分为5组，分别为空白组、模型组、阳性组、低剂量和高剂量孩儿参多糖组，每组8只。多糖的剂量参照细胞试验的结果设置。参照文献1315的方法，用脱毛膏对小鼠的背部进行脱毛，背部显露部位大小为2 cm2 cm；用体积比为31的丙酮橄榄油溶液配制DNFB试剂，于第1、4天在空白组小鼠的脱毛处涂抹体积比为31的丙酮橄榄油100 L，其他组则在脱毛处涂抹0.5%DNFB溶液100 L，分别进行致敏和加强致敏处理；于第7、10、13天在空白组小鼠的脱毛处涂抹体积比为31的丙酮橄榄油100 L，其他组则在脱毛处涂抹0.2%DNFB溶液100 L进行激发；同时，在第514天，每天早晚2次进行涂抹给药，空白组和模型组涂抹体积比为31的丙酮橄榄油100 L，阳性组涂抹0.5%的泼尼松龙乳膏100 L，低剂量、高剂量孩儿参多糖组分别涂抹100、500 g/mL的孩儿参多糖100 L，涂抹给药持续10 d。1.4小鼠经皮失水率检测和皮损评估及组织病理观察采用皮肤水分流失(TEWL)测试仪(TM300，德国368湖南农业大学学报(自然科学版)http:/2023 年 6 月CK)，于致敏前和最后 1 次涂药后 2 h 分别检测小鼠背部皮肤的经皮失水率。参照文献16的方法，于试验结束后，对小鼠的皮损进行评分，根据皮肤的红斑、表皮脱落、鳞屑、水肿等症状的无、轻、中、重 4 个等级，分别评分为 0、1、2、3，最后进行汇总，评分越高，表明皮肤的皮损程度越严重。试验结束后，参照文献17的方法，取小鼠背部受损皮肤组织进行 HE 染色，运用 CKX53 电子显微镜(奥林巴斯)进行拍照和组织病理分析。1.5细胞因子检测参照文献6的方法，采用 BCA 法测定小鼠皮损组织的蛋白含量；按照 ELISA 试剂盒说明书检测小鼠皮损组织中 FLG、CLDN1、I