多功能菌株的筛选及其在次生盐渍化土壤中的应用_王芷.pdf

第 3 期第 53 卷工业微生物基金项目：上海市科技兴农项目（沪农科推字（2021）第 2-2 号）；上海市浦东新区科技发展基金（PKJ2022-N02）。作者简介：王芷（1997），女，硕士研究生，研究方向：环境微生物，E-mail:。*通讯作者：李保国（1961），男，工学博士，教授，研究方向：食品和农产品加工新技术，E-mail:。刘莉（1982），女，工学博士，副研究员，研究方向：环境微生物，E-mail:。多功能菌株的筛选及其在次生盐渍化土壤中的应用王芷1，邵毅恒1，李保国1*，刘莉2,3*1.上海理工大学健康科学与工程学院，上海 200093；2.中国科学院上海高等研究院，上海 201210；3.上海有机固废生物转化工程技术研究中心，上海 200241摘要：次生盐渍化和土传病害是导致设施栽培连作障碍的主要因素，为了缓解设施栽培的连作障碍，从土壤中筛选多功能菌株并应用于连作障碍土壤中成为一种新的研究思路。文章通过对 12 株菌株的硝酸盐降解能力、产胞外聚合物（EPS）能力、降碱能力、抑菌能力进行验证，优选出硝酸盐降解能力最强的假单胞菌（Pseudomonas sp.）N11，EPS 产量最高的琼氏不动杆菌（Acinetobacter junii）S27，抑菌效果最好的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Y2，并将其制成混合菌剂运用于次生盐渍化土壤中。实验组对土壤中硝酸盐的降解率可达 31.71%，而对照组仅为 15.28%，说明混合菌剂降盐效果显著。筛选出的多功能菌株，可有效改善连作障碍土壤的次生盐渍化和土传病害问题，为提高设施蔬菜栽培产量提供可靠的技术手段。关键词：土壤；连作障碍；硝酸盐；设施栽培；胞外聚合物doi：10.3969/j.issn.1001-6678.2023.03.027第 53 卷第 3 期2023 年 6 月工业微生物Industrial MicrobiologyVol.53 No.3Jun.2023土壤次生盐渍化和土传病害普遍存在于设施栽培土壤中，是制约设施栽培产业发展的重要因素。次生盐渍化产生的原因是氮肥施用率过高导致大量无机氮主要以硝酸盐的形式存在于土壤中1-2，相比于露天栽培，设施栽培长期处于高温高湿的环境中，能够促进有机质的快速分解和盐离子的释放，从而加剧土壤次生盐渍化问题1-2。研究表明，土壤发生次生盐渍化后大量盐离子在土壤表层堆积，严重阻碍了作物根系的生长并限制其对养分的吸收3，从而影响设施栽培的产量和品质；土传病害是由于长期单一的种植模式导致土壤微生物结构遭到破坏，有益微生物减少，病原微生物富集，引发各种土传病害，从而造成设施栽培产量减少、质量下降，因此土壤次生盐渍化和土传病害成为设施栽培急需解决的问题。目前，解决土壤次生盐渍化问题的方法主要有物理修复和微生物修复4-5。物理修复主要包括灌溉洗盐、土壤更换、地膜覆盖。灌溉洗盐通常采用滴灌和渗灌的灌溉方式，二者均能有效降低土壤盐分含量，缓解盐渍化趋势；但灌溉洗盐只是一种暂时性的解决方法，因为该方法会使硝酸盐渗到地下水中造成二次污染，而且设施栽培条件下温度较高，硝酸盐会随着蒸发运动重新回到土壤表层6-8。土壤更换指的是取出已发生次生盐渍化的设施土壤，重新换入新的栽培基质。地膜覆盖是在保护地的内畦面上覆盖地膜以抑制表土积盐9-10。解决土传病害问题的方法主要有物理修复、化学修复和微生物修复。物理修复主要有土壤暴晒消毒，通过土壤暴晒，降低病原微生物的生存繁殖能力和致病力；但物理修复一般不能有效长期地改善土壤次生盐渍化和土传病害的问题，且劳动强度大，易造成二次污染3,11-12。化学修复主要指使用化学农药，如甲霜灵、杀毒矾等，是人们广泛使用的手段，但长期不合理的使用化学农药会造成环境污染，破坏土壤的自我修复能力。微生物修复主要通过施用有益微生物菌肥来减少土壤中硝酸盐累积、抑制病原微生物的生长繁殖，从而改善土壤104-第 3 期第 53 卷王芷等：多功能菌株的筛选及其在次生盐渍化土壤中的应用的理化性质和生物性状；微生物修复具有无公害、无污染、成本低等优势，生产工艺较为简单，有助于保持生态平衡，并对作物具有促生作用。针对土壤次生盐渍化和土传病害等问题，本研究首先从土壤中筛得硝酸盐降解菌和土传病害拮抗菌，根据菌株形态学、生理生化特征和分子生物学方法对菌株进行鉴定，并对筛得的菌株的生长特性和土壤硝酸盐降解能力进行评价，以期为解决设施土壤连作障碍问题提供理论支持。1材料与方法1.1试验材料1.1.1 种子和供试菌株实验种子采用上海青种子。本实验室通过平板筛选从土壤中获得了 N11、N23、N2、N6、N3、Y1、Y33、Y2、S13、S27、S31、S2 菌株。病原菌：设施栽培中的土传病害主要有青枯病、软腐病和枯萎病。青枯病主要由青枯菌（Ralstoniasolanacearum）引起；软腐病主要由软腐果胶杆菌（Pectobacterium carotovorum）引起；枯萎病主要由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）引起。青枯菌（Ralstonia solanacearum）来自中国农业微 生 物 菌 种 保 藏 管 理 中 心；果 胶 软 腐 杆 菌（Pectobacterium carotovorum）来自中国普通微生物菌 种 保 藏 管 理 中 心；尖 孢 镰 刀 菌（Fusariumoxysporum）来自海南大学热带农林学院农药实验室；1.1.2培养基LB 培养基（g/L）：酵母 5、蛋白胨 10、NaCl 10、pH 7.0。固体培养基中琼脂的添加量为 1.5%2%。好氧硝酸盐降解菌的发酵培养基（g/L）：KNO31、K2HPO47.9、KH2PO41.5、葡萄糖 10、MgSO4 7H2O0.1、CaCl20.001、FeSO4 7H2O 0.01。产 EPS 菌株发酵培养基（g/L）：蔗糖 20、K2HPO40.2、KH2PO40.5、NaCl 100、MgSO4 7H2O 0.5、酵母 3。马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（g/L）：马铃薯浸出液 200、葡萄糖 20、琼脂粉 15。pH=10 的 LB 培养基：在 LB 培养基的基础上，用碳酸钠调节 pH 为 10。1.1.3供试土壤土壤为次生盐渍化土壤，采自上海市奉贤区光明五四农场；供试土壤的基本理化性质如表 1 所示。表 1供试土壤的理化性质1.2菌株筛选1.2.1好氧硝酸盐降解菌的筛选将筛得的菌株活化富集，接入以硝态氮为唯一氮源的好氧硝酸盐降解菌的发酵培养基中，30、200 r/min 恒温摇床培养 96 h，测定不同菌株对NO3-N 含量的影响，硝酸盐降解率如式（1）所示。=c0-c96c0100%（1）式中：为硝态氮降解率，%；c0为 0 h 的硝态氮浓度，mg/L；c96为 96 h 的硝态氮浓度，mg/L。1.2.2产 EPS 能力将筛得的菌株活化富集，接入产 EPS 菌株的发酵培养基中，30、200 r/min 恒温摇床培养 72 h。然后将发酵液以 7 000 r/min 的转速离心 10 min，保留上清液，将菌体置于 105 烘箱中烘至恒重。在上清液中加入 3 倍 95%乙醇于 4 下过夜醇沉，混合液 4 000 r/min 离心 30 min，去除上清液，将沉淀置于 105 烘箱中烘至恒重13-14。产 EPS 的量和菌株干重的比值就是单位重量菌株的 EPS 的产量。1.2.3抑菌试验（1）平板对峙试验15用直径为 6 mm 的打孔器在长满 Fusariumoxysporum 的平板上打孔，将病原菌块倒置在 PDA平板中央，用灭菌的牙签挑取少许分离纯化后的单菌落点接在离病原菌块 25 mm 处对称的四周，PDA 平板中央只放置病原菌菌饼，周围不点接待测菌株作为对照组，30 培养直到对照组病原菌长至满板，记录对照与处理组菌落直径。抑菌率计算按式（2）。抑制率（%）=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/对照组菌落直径100%（2）（2）滤纸片抑菌试验16取 100 L Ralstonia solanacearum 和 Pectobacterium carotovorum 病原菌菌悬液涂布于 LB 固体培养基上，制成含菌平板。用打孔器制成直径为 6 mmpH有机质/（g kg-1）有效磷/（mg kg-1）速效钾/（mg kg-1）硝态氮/（mg kg-1）全盐量/（g kg-1）7.790.1418.001.3475.001.87290.008.26252.002.213.140.04105-第 3 期第 53 卷工业微生物的滤纸圆片，将滤纸片灭菌后，放置在 OD600=1.2 的菌液中浸泡 10 min，取出滤纸片平贴于上述含菌平板上，将平板倒置放入30 恒温培养箱中培养 24 h，用游标卡尺以十字交叉法测量抑菌圈直径。每组做三个平行试验，计算抑菌圈直径平均值。1.2.4降碱能力将筛得的菌株活化富集，接入 pH=10 的 LB 液体培养基中，30、200 r/min 恒温摇床培养 24 h，测定各个样品中 pH 的变化。菌株的降碱率由式（3）计算。=pH前-pH后pH前100%（3）式中：为降碱能力，%；pH前为发酵前培养基的pH；pH后为发酵前培养基的 pH17。1.2.5菌种的鉴定用 16S rRNA 序列比对法，采用细菌通用引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和1492R（5 GGTTACCTTGTTACGACTT-3）进行PCR 扩增，送至上海杰李生物技术有限公司进行纯化测序。1.3菌株硝酸盐降解效果的测定将 5%的菌株接种在 100 mL 以硝酸钾为唯一氮源、葡萄糖为唯一碳源的好氧硝酸盐降解菌的发酵培养基中，30、200 r/min 恒温摇床培养，分别于0、6、12、24、36、48、72、96 h 时取样测量 OD600、NO3-N、NO2-N、NH4+-N 的浓度变化18。1.4混合菌剂在不同硝态氮浓度下对上海青种子发芽的影响将菌株以 5%的接种量接入 LB 液体培养基中于 30、200 r/min 条件下培养 24 h，将培养好的发酵液以 7 000 r/min 的速度离心 10 min 后去除上清液，用无菌水重悬成 OD600=0.5 的重悬液。将筛得的菌株以等比例制成混合菌液。挑选大小一致的上海青种子，用 75%的乙醇消毒 3 min，之后用无菌水清洗干净。将处理后的种子于室温下在混合菌液中浸泡 3 h。选用无菌培养皿，其中含有不同硝酸盐浓度（0、50、100、150、250、500、750、1000 mg/L）的潮湿无菌滤纸，每组重复 3 次，对照组用无菌水浸泡。所有培养皿均在 30 温室培养箱中培育。4 d 后，统计发芽种子数量计算发芽率（GR），并测量发芽种子的根长和茎长。利用式（4）计算简化活力指数（SVI）。SVI=（平均根长+平均茎长）GR（4）1.5混合菌剂对土壤中硝酸盐的降解采集次生盐渍化较为严重的土壤，往其中添加混合菌剂，监测其对土壤硝酸盐含量的影响。将采集的土壤过 5 mm 筛后混匀，每个瓶中装入 300 g 次生盐渍化土壤。实验设置为 2 个组：（1）对照组（CK），不加入菌液；（2）实验组（T），接种混合菌液。每个处理重复三次操作19-21。混合菌液浓度为 1.2107CFU/mL。将菌液加入装有盐渍化土壤的无菌瓶中，对照组加无菌水，放入恒温培养箱中 25 培养4 周，每周定时取样测定土壤中硝酸盐含量。1.6测定方法OD600采用吸光度法测定；NO3-N 采用紫外分光光度法；NO2-N 浓度采用 N-（1-萘基）-乙二胺光度法（GB 7493-87）；NH4+-N 浓度采用纳氏试剂分光光度法；TN 浓度采用 TOC/TN 仪测定。2结果与分析2.1多功能菌株的筛选2.1.1好氧硝酸盐降解菌的筛选对从土壤中筛出的 12 株菌株进行好氧硝酸盐降解性能测定，如图 1 所示。从图 1 可以看出，这 12株菌株中有 6 株对硝态盐的降