泛素结合酶E2变体蛋白对MEFs细胞衰老的影响_徐舜.pdf

第 41 卷第 3 期2023 年 6 月广东医科大学学报JOURNAL OF GUANGDONG MEDICAL UNIVERSITYVol.41 No.3Jun.2023255泛素结合酶E2 变体蛋白对MEFs 细胞衰老的影响徐舜1,2,骆诗凌1,2,谢健鸿1,2,刘新光1,2,3,袁源1,2*（1.广东省医学分子诊断重点实验室，广东东莞 523808;2.广东医科大学衰老研究所，广东东莞 523808;3.广东医科大学生物化学与分子生物学研究所，广东东莞 523808）摘要：目的探讨泛素结合酶E2 变体蛋白（UBE2V1）对MEFs 细胞衰老的影响。方法Western blot 检测UBE2V1在年轻（2 月龄）和年老小鼠（24 月龄）各组织中的表达差异，以荧光定量PCR 及Western blot 检测UBE2V1 在年轻和衰老MEFs 细胞中表达的差异，荧光定量PCR 和Western blot 验证Ube2v1 基因的siRNA 沉默效果，-半乳糖苷酶染色检测Ube2v1 表达下调对MEFs 细胞衰老的影响，Edu 和Alarmar Blue 检测Ube2v1 基因沉默后MEFs 细胞增殖能力的变化。结果UBE2V1 在衰老小鼠的心脏、肝脏、肾脏和脑组织中表达下调，同时在衰老的MEFs 细胞中也明显表达下调，在年轻细胞中沉默Ube2v1 基因后-半乳糖苷酶染色结果显示衰老的细胞数量明显增加，且Edu 和Alarmar Blue 检测发现Ube2v1 基因沉默后MEFs 细胞增殖能力显著下降。结论沉默Ube2v1 可通过抑制MEFs 细胞增殖，从而促进细胞衰老。关键词：UBE2V1；MEFs；衰老中图分类号：Q 291 文献标志码：A 文章编号：2096-3610（2023）03-0255-04Effect of ubiquitin-binding enzyme E2 variant on cellular senescence of MEFsXU Shun1,2,LUO Shi-ling1,2,XIE Jian-hong1,2,LIU Xin-guang1,2,3,YUAN Yuan1,2*(1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Medical Molecular Diagnostics,Guangdong Medical University,Dongguan 523808,China;2.Institute of Aging Research,Guangdong Medical University,Dongguan 523808,China;3.Institute of Biochemistry&Molecular Biology,Guangdong Medical University,Dongguan 523808,China)Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of ubiquitin-binding enzyme E2 variant(UBE2V1)on cellular senescence of MEFs.MethodsWestern blot was used to detect the difference of UBE2V1 expression in the tissues of young(2 months of age)and old(24 months of age)mice.Quantitative PCR and Western blot were used to detect the difference of UBE2V1 expression in young and senile MEFs cells.Quantitative PCR and Western blot were used to verify the siRNA silencing effect of Ube2v1 gene.-galactosidase staining was used to detect the influence of downregulation of Ube2v1 expression on aging of MEFs cells.Edu and Alarmar Blue were used to detect the changes of proliferation ability of MEFs cells after Ube2v1 gene silencing.ResultsUbe2v1 was down-regulated in the heart,liver,kidney and brain tissues of aging mice,and also down-regulated in aging MEFs cells.-galactosidase staining results showed that the number of aging cells increased significantly after Ube2v1 gene was silenced in young cells.Edu and Alarmar Blue tests showed that the proliferation ability of MEFs cells decreased significantly after Ube2v1 gene silencing.ConclusionSilencing Ube2v1 inhibits MEFs cell proliferation and thus promote cell senescence.Key words:UBE2V1;MEFs;senescence衰老是指人体在其生长发育达到成熟期以后，随着年龄的增长，在形态、结构和生理功能方面必然出现的一系列全身性、多方面的退行性变化，如皮肤萎缩、骨收稿日期：2023-03-09基金项目：国家自然科学基金（81671399），广东省医学科研基金（A2020173），广东医科大学科研基金面上培育项目（GDMUM201803），广东省大学生创新创业训练计划项目（201810571105，S202110571102，S202210571066），广东医科大学大学生创新实验项目（2020ZYDB002，2020ZZDB003），广东医科大学科研基金自然科学类重点培育项目（GDMUZ2020003）作者简介：徐舜（1984-），男，博士，副研究员，E-mail:xushun 通信作者：袁源（1986-），男，博士，讲师，E-mail:yuanyuan 质丢失等1-2。细胞衰老是指细胞生理功能的衰减，包括增殖能力下降、细胞周期停滞、对促凋亡应激原不敏感、衰老相关基因和蛋白表达增加，并伴有形态学的广东医科大学学报2562023年 第41卷衰老改变，且渐趋于死亡的现象3-5。在细胞培养过程中，野生型（wild type，WT）MEFs 在传代过程中刚开始生长相对缓慢，到第 3 代开始经历生长旺盛期，一般经过连续传代至第 8 代左右才进入细胞衰老状态6，MEFs 细胞作为经典的复制性衰老细胞，可作为本研究良好的细胞模型。已有研究表明，在HT-29-M6 细胞中过表达UBE2V1 可抑制细胞的分化7。但至目前为止，泛素结合酶E2 变体蛋白（ubiquitin conjugating enzyme E2 V1，UBE2V1）在衰老方面的研究还处于探索阶段。本研究旨在探讨UBE2V1 在细胞衰老进程中的作用，通过在MEFs 中沉默UBE2V1 观察细胞衰老情况，检测细胞增殖变化，初步揭示UBE2V1 参与细胞衰老的进程，提示其影响细胞衰老的潜在作用。1材料和方法1.1材料MEFs 细胞为本实验室自制；siRNA 购自锐博生物技术有限公司；DMEM、胎牛血清、胰酶等购自 Life Technologies 公司；TEMED、过硫酸铵、SDS 购自Sigma 公司；ECL 底物显色试剂盒购自Thermo 公司；DAPI 染液购自 Gibco 公司；Lipofectamine RNAi MAX为Invitrogen 公司产品；UBE2V1 抗体（sc-390047）购自 Santa-Cruz 公司；细胞衰老-半乳糖苷酶染色试剂盒、二抗购自碧云天公司，其余为国产分析纯试剂。1.2细胞培养MEFs 细胞复苏后，采用含 15%胎牛血清的DMEM培养基于 37、5%CO2培养箱培养，待细胞长到 80%90%融合度时，按照 12 的比例传代培养。1.3细胞转染 使用胰蛋白酶消化MEFs 细胞后，接种至 12 孔板和 24 孔板。置于细胞培养箱继续培养 24 h，待细胞长到 30%50%融合度时，将siRNA 充分溶解于不含有血清的转染专用培养基Opti-MEM 中。RNAiMAX 用Opti-MEM 稀释后，与siRNA 溶液混合，轻轻振荡后，置于室温5 min，加入细胞培养板，放入细胞培养箱中。转染 48 h 后，收集细胞。1.4-半乳糖苷酶染色细胞接种于 12 孔板，采用-半乳糖苷酶染色试剂盒（碧云天）对细胞进行固定和染色，普通光学显微镜下观察染色结果并拍照，衰老细胞镜下呈深蓝色着染。1.5细胞增殖的检测细胞接种于 24 孔板，待细胞长到约 80%融合度时依次进行Edu 标记、细胞固定化、Apollo 染色、DNA 染色。在荧光显微镜下观察染色结果并拍照。1.6Western blot取12孔板中的细胞样品，胰酶消化收集细胞悬液，1 000 g 离心 5 min，去上清，加入 100 L 配制好的细胞裂解液，冰上充分裂解 15 min 后，加入 80 L 2SDS Loading Buffer，沸水煮 10 min 使蛋白样品变性。将蛋白样品加入提前制好的蛋白胶孔中，每孔 10 L 经SDS-PAGE 分离，随后在转膜槽中经 300 mA、1 h 转移至PVDF 膜上，用含 3%BSA 的TBST 室温封闭 1 h，分别加入相应蛋白抗体（11 000 稀释）于 4 孵育过夜。第 2 天用TBST 漂洗 10 min，洗 3 次，加 15 000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育 1 h，用TBST 漂洗 10 min，洗 3 次，加入ECL 化学发光液，于Azure Biosystems C400 凝胶成像系统曝光拍照。1.7统计学处理使用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计学处理，所有实验均重复 3 次，计量资料采用配对t 检验或单因素方差分析，P0.05 表示差异有统计学意义。2结果2.1UBE2V1 在衰老小鼠组织中表达显著下调利用Western blot 检测UBE2V1 在年轻（2 月龄）和年老小鼠（24 月龄）各组织中的表达差异，发现UBE2V1 在年老小鼠的心脏、肝脏、肾脏和脑组织中表达显著下调（图 1）。2.2UBE2V1 在衰老的MEFs 细胞中表达显著下调利用荧光定量PCR 及Western blot 检测UBE2V1在年轻和衰老MEFs 细胞中的表达差异，发现在衰老的MEFs 细胞中UBE2V1 表达也显著下调（图 2）。2.3siRNA 沉默UBE2V1 的表达促进MEFs 衰老利用荧光定量 PCR 和 Western blot 验证 UBE2V1基因的siRNA 沉默效果，如图 3A、B 所示，siRNA-1、siRNA-2 和siRNA-3 都能较好沉默UBE2V1 基因的表达，而UBE2V1 基因下调能显著促进MEFs 的衰老（图 3C）。2.4沉默UBE2V1 显著抑制MEFs 细胞增殖通过转染siRNA，待细胞密度长到 80%时，采用EdU 标记MEFs 细胞的增殖能力。Edu 检测发现，MEFs 细胞中UBE2V1 基因沉默后，与对照组比较，细胞增殖能