大麦申请保护品种DNA指纹图谱构建_冯艳芳.pdf

分子植物育种，2023 年，第 21 卷，第 14 期，第 4685-4693页Molecular Plant Breeding,2023,Vol.21,No.14,4685-4693基金项目：本研究由农业农村部物种品种资源保护费项目(00020)资助引用格式：Feng Y.F.,Ma Y.X.,Li A.A.,Pang X.B.,Liu X.J.,Ding X.H.,and Han R.X.,2023,DNA fingerprint construction of thebarley variety for protection,Fenzi Zhiwu Yuzhong(Molecular Plant Breeding),21(14):4685-4693.(冯艳芳,马莹雪,李嫒嫒,庞雪兵,刘雪景,丁小惠,韩瑞玺,2023,大麦申请保护品种 DNA 指纹图谱构建,分子植物育种,21(14):4685-4693.)研究报告Research Report大麦申请保护品种 DNA 指纹图谱构建冯艳芳马莹雪李嫒嫒庞雪兵刘雪景丁小惠韩瑞玺*农业农村部科技发展中心,北京,100176*通信作者,摘要本研究采用农业行业标准 大麦品种鉴定技术规程 SSR 分子标记法(NY/T 2466-2013)中的 28 个标记对 142 份大麦申请品种进行 DNA 指纹采集和遗传多样性分析。28 个标记共检测到 196 个等位变异和314 个基因型，平均值分别为 7 和 11.2，PIC 值范围为 0.14060.7904，平均值为 0.585 3。聚类结果显示，142 份材料可以完全区分，遗传距离范围为 0.031 40.974 7，平均值为 0.617 2。本研究分别以字符串形式和条形码格式表示 142 份大麦品种的 DNA 指纹图谱，每一份品种的指纹都具有唯一性，指纹数据可作为大麦新品种保护受理审查的参考依据和技术支撑，有利于大麦育种创新和新品种推广。关键词大麦;品种保护;SSR;指纹图谱DNA Fingerprint Construction of the Barley Variety for ProtectionFeng YanfangMa YingxueLi AiaiPang XuebingLiu XuejingDing XiaohuiHan Ruixi*Development Center of Science and Technology,Beijing,100176*Corresponding author,DOI:10.13271/j.mpb.021.004685AbstractBased on the industry standard Identification of barley varieties-SSR method(NY/T 2466-2013),wecarried out DNA fingerprint construction and genetic diversity analysis on 142 barley varieties with 28 markers.Total of 196 alleles and 314 genotypes could be detected by using these 28 pairs of markers,with an average valueof 7 and 11.2,respectively.PIC values ranged from 0.140 6 to 0.790 4,with a mean value of 0.585 3.The range ofpolymorphism information content(PIC)at 28 markers were 0.140 60.790 4,with an average of 0.585 3.Clusteranalysisshowed that,142 varietiescould be completelyidentified,the range ofgenetic distance was0.031 40.974 7,with an average value of 0.617 2.According to the result,we constructed the fingerprint map of the 142 varieties intheformofstringandbarcode.Thefingerprintofeachvarietyisunique,whichprovidedreferencebasisandtechnicalsupport for barley variety protection.Our study would benefit barley breeding and promotion of new variety.KeywordsBarley;Variety protection;SSR;Fingerprint大麦(Hordeum vulgare L.)，又名牟麦、饭麦、赤膊麦，营养成分与小麦相接近，是世界第四大谷物(胡倩文等,2020)，也是遗传学上广泛应用研究的模式植物之一。大麦谷蛋白(Glutenin)含量少，可以做不发酵的食物，一般用于粮食、饲料、药品以及保健食品，其麦芽是制作啤酒的原材料(卢良恕,1996,中国农业出版社,pp.124)。大麦于 2003 年列入中华人民共和国农业植物新品种保护名录(第五批)，是非主要农作物，新品种通过登记即可推广。构建大麦 DNA 指纹库，有利于大麦的品种鉴定，维护其市场秩序，保护育种者权益。分子标记是以核苷酸排列顺序变化为基础的标记基因，是生物个体在 DNA 水平上遗传多态性的直接表现，受地理环境、季节因素影响较小(张蓝天等,2020)，是品种鉴定的重要辅助手段之一。目前，在大分子植物育种Molecular Plant Breeding麦性状关联分析、种质资源遗传多样性评价及亲缘关系鉴定等研究中常用的 DNA 分子标记主要有 RFLP(Restriction fragment length polymorphism)、RAPD(Random amplified polymorphic DNA)、AFLP(Amplified fragment length polymorphism)、SSR(Simple se-quence repeat)及 InDel(Insertion-deletion)标记(张镝和丁毅,2007;Okada et al.,2008;王艳平等,2013;赖勇等,2016;徐婷婷等,2020)。简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)，也叫微卫星 DNA，是由 27 个碱基的重复核苷酸序列构成的多态性 DNA 标记，长度可达几十个核苷酸，其重复单元的重复次数在个体间呈现高度的差异性，即在同一个基因位点创造了多个不同的等位基因。作为目前应用较为广泛的分子标记，SSR 具有多态性高、数量丰富、稳定性佳、重复性好等特点。中国于2013 年 12 月发布了 大麦品种鉴定技术规程 SSR分子标记法(NY/T 2466-2013)农业行业标准。目前，以 SSR 为基础的指纹检测技术已非常成熟，SSR 荧光标记毛细管电泳技术的检测结果呈现的是目的片段的准确大小，大大降低了分辨扩增产物的难度，提高了研究的效率和准确性。以字符串、条形码以及二维码等形式表示的检测结果，称为 DNA分子身份证，它可以精准、简洁地方式代表不同的品种或品系。目前，大麦品种指纹图谱的分子身份证构建工作研究相对较少。本研究根据发布的大麦分子检测行业标准，通过 SSR 荧光标记毛细管电泳技术构建大麦申请保护品种的 DNA 指纹图谱，为大麦品种保护提供数据支撑，并以此促进大麦的品种创新和遗传育种。1结果与分析1.1遗传多样性分析28 对标记在 142 份材料上扩增得到 196 个等位变异，变异范围为 311，平均值为 7，其中 17 个标记在 142 份材料中的等位变异数大于等于 7 个；28 个标记共检测到 314 个基因型，范围为 419，平均值为11.2，PIC 值范围为 0.14060.7904，平均值为 0.585 3，其中标记 SCSSR03907 多态性最丰富，是 0.790 4，共检测到 17 种基因型。142 份大麦的基因多样性范围为 0.149 90.814 1，平均值为 0.625 8(表 1)，说明试验材料具有较丰富的遗传多样性。浙秀 12 和 苏农 684在标记 BMAC0181 和 HVM40 上的扩增结果(图 1)。聚类分析结果表明(图 2)，28 对标记可以将 142份供试材料完全分开，遗传距离范围为 0.031 40.974 7，平均值为 0.617 2。其中 盐丰啤 2 号(DM103)和 民星麦 3 号(DM107)遗传距离最小，为 0.031 4，表现为 3 个位点的差异，二者按照标准判定为不同品种；QB14(DM059)和 凤啤麦 1 号(DM078)、甘垦啤0520(DM089)和 苏农 684(DM117)、甘啤 8 号(DM102)和 苏农 684(DM117)之间遗传距离最大，均为 0.9747。142 份材料可分为 4 个类群。其中 藏青320(DM055)、藏青 25(DM065)、昆仑 13 号(DM-031)、昆仑 10 号(DM056)、喜马拉 11(DM060)等聚在同一类，从品种名称可看出聚类结果与申请品种地理来源有一定联系；QB01(DM057)、QB14(DM059)、QB24(DM058)、QB27(DM054)以及垦啤麦 2 号(DM091)、垦啤麦 8 号(DM012)、垦啤麦 9 号(DM020)、垦啤麦 10 号(DM041)、垦啤麦 15 号(DM136)各自聚在一起，上述品种系属同一家单位的育成品种，分别聚为一类可能是在性状或父母本的选择上有相同或相似之处，聚类结果符合遗传规律。此外，约 75%的大麦品种聚为一类，这可能是因为大麦研究材料绝大部分为国内育成的申请品种，遗传背景较为狭窄。1.2 DNA指纹图谱编码及构建不同标记检测到的品种基因型进行组合可以将不同品种区分开，等位变异越多越能反映品种间的差异。根据检测到的标记等位基因差异，按照标记顺序(表 1)建立 142 个大麦品种的指纹图谱，对毛细管电泳结果进行数字及英文字母编码，每个品种可得到唯一的字符串编码(表 2)。按顺序将该 28 对标记对应的编码组合，构成每个品种的 DNA 分子身份证。如 浙啤 33(DM024)的 DNA 分子身份证编码为A57991661E2556726G7934621428，依照编码表中内容，第 1 个字母 A 表示标记 BMAC0018 在 浙啤33中的目的片段，在其多态性片段梯度中排第 10 位，第 2 个数字 5 表示标记 BMAC0064 在浙啤 33 中的目的片段，在其多态性片段梯度中排第 5 位，其他代码依次类推。将每个样品对应的身份证编码导入在线条码生成器，生成对应的条形码 DNA 分子身份证。基于字符串成功构建出 142 份大麦申请品种的DNA 分子身份证，其中 浙啤 33(DM024)的条形码DNA 分子身份证(图 3)。2讨论随着育种技术的加快和种质资源评价的深入，4686表 1 28 个标记在 142 份材料中的多态性Table 1 The polymorphism of 28 markers among the 142 tested varieties标记MarkerBMAC0018BMAC0064BMAC0181BMAC0209BMAG0009BMAG0211BMAG0353BMAG0378BMAG0387BMAG0711BMAG0867BMAG0877EBMAC0603EBMAC0635EBMAC0701HVCMAHVM27