仓储小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测技术的优化_李瑞姣.pdf

第 3 期第 53 卷工业微生物基金项目：上海市科学技术委员会社会发展科技攻关项目（21DZ1201300）资助。作者简介：李瑞姣，女，硕士研究生，研究方向：农产品质量安全。E-mail:。*通讯作者：孟佳佳，女，博士，助理研究员，研究方向：农产品质量安全。E-mail:。仓储小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测技术的优化李瑞姣1,2，黄晴雯2，聂冬霞2，娄秀萍2,3，杨俊花2，韩铮1,2,3，孟佳佳2*1.上海理工大学健康科学与工程学院，上海 200093；2.上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，上海 201403；3.上海海洋大学食品学院，上海 201306摘要：脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）是小麦仓储过程中的重要危害因子，其污染水平是仓储公司定期检测的重要指标。为提高 DON 检测的平行性和准确度，文章对仓储小麦 DON 检测过程中样品制备和酶联免疫吸附法（ELISA）检测关键技术进行优化。结果表明：样品制备过程中，将扦样后的样品先粉碎再分样的处理方法（方法 2）明显优于先分样再粉碎的方法（方法 1），测定样品的相对标准偏差由 25.28%降至 7.42%。另外，将 ELISA 检测过程中两种不同的移液枪使用方法（前进移液法和反向移液法）进行比较，发现前进移液法在 10 次测定中结果相对标准偏差较小，平行性较好；且加样过程中，采用不贴壁加样方式会使检测值更加准确，平行性也较好。优化后的仓储小麦中 DON 毒素 ELISA 快速检测技术具有较好的平行性和准确度，可用于实际仓储小麦中 DON 毒素的准确、快速检测。关键词：仓储；小麦；脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）；酶联免疫吸附法（Enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA）doi：10.3969/j.issn.1001-6678.2023.03.029第 53 卷第 3 期2023 年 6 月工业微生物Industrial MicrobiologyVol.53 No.3Jun.2023脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON），又 称 呕 吐 毒 素，是 由 禾 谷 镰 刀 菌（Fusariumgraminearum）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）等霉菌产生的一种重要的单端孢霉烯族真菌毒素1。DON 具有急性毒性（引起腹泻、呕吐、直肠出血等）和慢性毒性（导致厌食、体重减轻、发育不良等），欧盟将其定为三级致癌物质。DON 主要污染小麦、玉米、大麦等谷物及其制品和副产品，污染地区遍布全球2-3，为人和动物的健康带来巨大的安全风险。小麦是我国主要的粮食作物，其储存周期较长，麦堆温湿度会随外界环境发生季节性变化，而水分含量高的地区更利于微生物生长繁殖引起谷物霉变，造成品质下降4-5。在仓储小麦真菌毒素筛查中发现，江苏地区的小麦比山东地区小麦 DON 污染严重得多，检出率高达 40.68%6。温晓燕等6对在上海地区采集的 119 份仓储小麦进行 DON 污染分析发现，检出率达 33.61%，质量分数为 2.88199.14 滋g/kg。我国作为小麦食用大国，高度重视 DON 污染问题，2013 年国家风险监测计划已将小麦粉中 DON含量的监测列为重点7-8。中国规定谷物中 DON 的最大残留限量为 1 000 滋g/kg9，欧盟委员会（EC 法规 1126/2007）将供人类直接食用的谷物中 DON 的最大残留限量设为 750 滋g/kg10。目前，DON 的检测方法主要包括超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）11、高效液相色谱法12、气相色谱法13、气相色谱串联质谱联用法14、酶联免疫吸附法（ELISA）15、电化学分析16等。其中，ELISA 检测方法以其操作简单、快速、低成本，且适用于大批量样品筛选等优点，愈发受到研究者的关注17，是目前仓储公司检测仓储小麦中 DON 等毒素最常用的方法，其检测基本过程（如图 1 所示）：使用120-第 3 期第 53 卷扦样器从粮仓不同部位采集小麦样品，扦样后的样品经混匀、分样、粉碎等过程制备成检测样品（即双试样，扦样样品混合均匀后由分样器分成约 1 kg 的次级样品，将所得的次级样品进一步用分样器分出两份质量相同的检测样品（每份约 100 g），粉碎后即为双试样），随后按照 ELISA 试剂盒上的操作步骤进行 DON 毒素含量的测定。但在仓储公司对储藏的小麦中 DON 毒素含量的实际检测过程中发现，双试样间的检测结果经常差别较大，且检测重复性差，难以判断 DON 毒素的真实污染水平。本研究针对仓储公司实际检测中遇到的问题，对其常用的检测方法中样品制备和 ELISA 检测过程中移液枪使用方法及加样方式的关键技术进行优化（图 1），并且将优化后的 ELISA 检测方法与实验室常用的 UPLC-MS/MS 检测方法进行比对验证。为解决仓储小麦中 DON 毒素检测平行性和准确度差的问题提供理论基础和数据支撑。1材料与方法1.1材料与试剂小麦样品采自上海浦江仓储有限责任公司，DON 标准品（100 滋g/mL），乙腈（色谱纯）；呕吐毒素ELISA 检测试剂盒。1.2仪器与设备酶标仪 Infinite M200，多管涡旋混匀仪 DMT-2500，电子天平，离心机，UPLC XEVOTQ-S 超高效液相色谱-串联质谱联用仪，Milli-Q 超纯水仪，分样器，扦样器。1.3扦样从上海浦江仓储有限责任公司的粮仓中采集小麦样品，平房粮仓装粮高度为 6 m 左右，本研究分为四层扦样，分别选择五个位置（西北角、东北角、西南角、东南角及中心点）的上层、中上层、中下层、下层作为本试验的采样点，每个点的扦样量不小于 3kg。1.4检测样品的制备将采集的 3 kg 扦样样品经混匀分样、粉碎等处理制备成检测样品。仓储公司常用的样品制备方法为：将扦样小麦样品用分样器分为 1 kg 次级小麦样品，再分成 2 份 500 g 的小麦样品（其中一份样品用于留样），另外一份 500 g 检测样品用分样器分出 2个约 100 g 的样品，将样品分别粉碎后得到双试样，用于检测其中 DON 的含量，如图 2 方法一所示。本试验对粮仓常用的样品制备方法进行了优化，优化后的样品制备方法为：将扦样样品用分样器分为 1 kg 的次级样品后，用研磨机全部磨粉，分成2 份 500 g 的小麦粉样品，其中一份用于留样，从另一份 500 g 小麦粉样品中取出 2 份 100 g 的小麦粉样品（即双试样），用于检测其中 DON 的含量，如图2 方法二所示。1.5样品 ELISA 试剂盒检测制备好的双试样按照 ELISA 试剂盒的操作步骤进行，检测其中 DON 毒素的含量。（1）提取从准备好的样品中，称取 5.00 g 样品置于 50mL 离心管中，每份样品重复三次。加入 25 mL 去离图 1仓储小麦中 DON 检测流程图3 kg 左右小麦样品扦样器仓储小麦粮仓研磨机研磨机样品1：约100 g样品1：约100 g（小麦粉）样品2：约100 g（小麦粉）样品2：约100g分样器分样器约500 g小麦样品（用于检测）约500 g小麦样品（用于留样）次级样品样品制备方法先分样再粉粹先粉粹再分样双试样提取移液枪使用方式移液枪加样方式前进移液法反向移液法枪头不接触孔壁枪头接触孔壁ELISA 检测小麦检测样品制备扦样李瑞姣等：仓储小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测技术的优化121-第 3 期第 53 卷工业微生物子水将其混匀；在振荡器上剧烈振荡 10 min，转速为 2 500 r/min；提取液置于离心机中室温离心 5min，转速为 4 000 r/min；取 1 mL 上清液，加入 4 mL去离子水，涡旋 1 min，待用。（2）ELISA 试剂盒检测从冰箱中取出 DON 毒素 ELISA 测试盒，待其温度恢复至室温。加标准品/样品：加标准品/样品 50 滋L/孔于对应微孔中，再加入 DON 酶标物 50 滋L/孔，最后加入DON 抗试剂 50 滋L/孔，轻轻震荡摇匀，用盖板膜盖板后置于 25 益避光环境中反应 30 min。洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用250 滋L/孔的洗涤液充分洗涤 45 次，每次间隔 10s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。显色：加入底物液 A 液 50 滋L/孔，再加底物液B 液 50 滋L/孔，轻轻震荡摇匀，用盖板膜盖板后置于25 益避光环境中反应 15 min。测定：加入终止液 50 滋L/孔，轻轻振荡摇匀，设定酶标仪于双波长 450/630 nm 处检测，检测每孔吸光度（OD）值。1.5.1ELISA 试剂盒检测过程中关键技术的优化1.5.1.1 移液枪的使用在 ELISA 检测过程中移液枪的使用频率较高，所以其移取溶液的准确性直接影响到 DON 毒素含量检测结果。在确保移液枪性能良好的基础上，规范操作方法可以提高试验结果的可靠性。所以将移液器常用的两种移液方法（前进移液法和反向移液法）进行对比，在一定温度下称量 50 滋L 溶液的重量，每种移液方式进行 10 次重复操作，并对称量结果进行单样本 T 检验。使用移液枪的两种方法具体操作如下。前进移液法：将按钮按下至第一停点，然后慢慢松开按钮回到原点；接着将按钮按至第一停点排出液体，稍停片刻继续按按钮直至第二停点吹出残余的液体，最后松开按钮。反向移液法：先按下按钮至第二停点，慢慢松开按钮回到原点；接着将按钮按至第一停点排出已设置好量程的液体，继续按住按钮使其保持在第一停点，取下有残留液体的枪头，弃之。如图 3 所示。图 3前进移液法和反向移液法示意图1.5.1.2 加样方式优化在 ELISA 检测过程中，加样方式是影响 ELISA检测结果准确性的重要因素。本试验分别采用枪头接触孔壁和枪头不接触孔壁两种不同的加样方式，图 2两种不同方法的样品制备流程图第一停点第二停点第一停点步骤 1：按置第一停点第一停点第二停点步骤 2：回置原点，吸取液体第二停点步骤 3：按置第二停点，排除液体前进移液法第二停点步骤 1:按置第二停点第一停点第二停点步骤 2：回置原点，吸取液体步骤 3：按置第一停点，排除液体反向移液法第一停点方法一：检测样品（500 g）分样器分样器分样器双试样（2伊100 g）检测研磨机小麦样品（2伊100 g）扦样（小麦 3 kg）留样样品（500 g）次级样品（小麦 1 kg）方法二：检测双试样（2伊100 g）检测样品（500 g）留样样品（500 g）小麦粉（1 kg）研磨机分样器次级样品（小麦 1 kg）扦样（小麦 3 kg）122-第 3 期第 53 卷李瑞姣等：仓储小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测技术的优化已知检测小麦样品中 DON 浓度为 150 滋g/kg，比较这两种加样方式的准确性，每种方式进行 3 次平行加样。1.6ELISA 方法与 UPLC-MS/MS 方法的比较本试验将优化后的 ELISA 检测方法与实验室常用的 UPLC-MS/MS 检测方法进行比对，以验证该方法的准确性。UPLC-MS/MS 检测方法为本研究所在实验室建立的方法18。称取 2.00 g 小麦粉于 50 mL离心管中，加入 20 mL 乙腈水（8416，V/V），超声30 min、涡旋 30 min、以 5 000 r/min 的速度离心 5min。取上清液 100 滋L，再加入 900 滋L 甲醇水（28，V/V），涡旋混匀 30 s，过 0.22 滋m 的滤膜，待测。色谱条件：色谱柱为 XBridge BEH-C18色谱柱（3.0伊100 mm，2.5 滋m）；流动相，流动相 A 为 5mmol/L 乙酸铵水溶液，流动相 B 为甲醇。梯度洗脱程序：03 min，30%B；35 min，30%B10%B；56min，10%B；66.1 min，10%B耀90%B；6.18 min，90%B；流速