茶树CsNCED2启动子互...筛选及在非生物胁迫中的响应_李佳思.pdf

茶叶科学 2023，43（3）：325334 Journal of Tea Science www.tea- 收稿日期：2023-02-12 修订日期：2023-04-03 基金项目：大学生创新创业训练项目（202110712028）、国家茶叶产业技术体系（CARS-19）、陕西省农业科技创新驱动项目（NYKJ-2022-YL(XN)37）、西北农林科技大学推广模式专项（TGZX2022-25）作者简介：李佳思，女，在读本科生，。*通信作者： 茶树 CsNCED2 启动子互作转录因子筛选及 在非生物胁迫中的响应 李佳思，刘迎庆，张永恒，张迎澳，肖烨子，刘露，余有本*西北农林科技大学园艺学院，陕西 杨凌 712100 摘要：9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）是脱落酸（ABA）合成过程中的关键限速酶，广泛参与植物的生长发育及非生物胁迫响应过程。茶树中 CsNCED2 参与响应盐胁迫和干旱胁迫，但其转录调控机制尚不明确。通过酵母单杂交文库筛选技术，获得 2 个结合茶树 CsNCED2 启动子的转录因子 CsDof5.4 和 CsERF38，亚细胞定位、酵母自激活检测及荧光素酶试验表明，它们都定位于细胞核并能激活 CsNCED2 的表达。RT-qPCR结果表明，在盐胁迫下，CsERF38 和 CsDof5.4 的表达均与 CsNCED2 的表达呈显著正相关；干旱胁迫下，只有 CsERF38与 CsNCED2的表达呈正相关。本研究筛选出 2个与茶树 CsNCED2 启动子互作的转录因子 CsDof5.4和 CsERF38，而干旱、盐胁迫均能诱导 CsNCED2 基因上调表达，从而参与茶树非生物胁迫响应过程。关键词：茶树；CsNCED2；转录调控；表达分析 中图分类号：S571.1，Q52 文献标识码：A 文章编号：1000-369X(2023)03-325-10 Identification of Transcription Factors Interacting with CsNCED2 Promoter and Their Response to Abiotic Stress LI Jiasi,LIU Yingqing,ZHANG Yongheng,ZHANG Yingao,XIAO Yezi,LIU Lu,YU Youben*College of Horticulture,Northwest A&F University,Yangling 712100,China Abstract:Nine cis epoxide carotenoid dioxygenase(NCED)is a key rate-limiting enzyme in abscisic acid(ABA)synthesis and widely involved in plant growth and development as well as abiotic stress response.CsNCED2 is involved in the response to drought and salt stress in tea plants,while the transcriptional regulation mechanism involved is still unclear.In this study,two transcription factors,CsDof5.4 and CsERF38,which binded to the CsNCED2 promoter were identified by yeast single hybrid(Y1H)library screening.Subcellular localization,yeast self-activation and luciferase(LUC)assay show that they were located in the cell nucleus and could activate the expression of CsNCED2.RT-qPCR results show that the expressions of CsERF38 and CsDof5.4 were highly correlated with CsNCED2 under salt stress.While under drought stress,only the expression of CsERF38was highly correlated with that of CsNCED2.In this study,two transcription factors(CsDof5.4 and CsERF38)binding to the CsNCED2 promoter were identified.Both drought and salt stresses could induce the expression of CsNCED2,thus participate in the abiotic stress response in tea plants.Keywords:tea plant,CsNCED2,transcriptional regulation,expression analysis DOI:10.13305/ki.jts.2023.03.007326 茶 叶 科 学 43 卷 脱落酸（Abscisic acid，ABA）是一种重要的植物激素，在植物种子休眠、萌发、生长、开花、果实成熟等生理活动中发挥关键作用1-5。同时，ABA 也是植物中的关键抗逆因子，参与了植物对多种逆境胁迫的响应过程，如植物在遭受干旱6、低温7、盐害8、病害9等胁迫时，植物体内会迅速积累 ABA，从而诱导一系列依赖于 ABA 信号的抗逆基因上调表达，引起植物抗逆性的增加10。近年来，大量的研究揭示了植物体内 ABA 的合成途径，其 中，9-顺 式-环 氧 类 胡 萝 卜 素 双 加 氧 酶（NCED）被鉴定为 ABA 合成过程中的关键限速酶，它的表达往往受到逆境胁迫诱导并与植物抗逆性相关11-12。水稻中的研究表明，干旱胁迫能诱导 OsNCED5 的表达，从而促进ABA 合成，增加了水稻的抗旱性13。而抑制GhNCED1 会导致棉花体内的 ABA 含量降低，增加了棉花对干旱和盐胁迫的敏感度12。研究表明，转录因子可以介导胁迫所诱导的 NCED 转录水平变化，一些转录因子通过激活 NCED 的表达来增加植物的抗逆性，也有一些转录因子通过抑制其表达从而降低植物的抗逆性。例如，拟南芥 AtWRKY57 通过结合到 AtNCED3 的启动子并激活其表达，促进 ABA 的积累，提高拟南芥的抗旱性14。在盐胁迫下，水稻 OsERF19 可以通过激活 OsNCED5的表达，进而影响水稻体内的 ABA 含量和耐盐性15。番茄中，bHLH 类转录因子 SlBZR1通过直接激活 SlNCED1 的表达来增加番茄中的 ABA 含量以提升番茄的抗寒能力16。也有一些转录因子通过抑制 NCED 的表达从而在植物应对逆境胁迫过程中发挥负面作用，如水稻 OsWRKY67 能抑制 OsNCED3 和 OsNCED4的表达，过量表达 OsWRKY67，导致水稻的抗旱性降低17。茶树中鉴定了 5 个 NCED 基因，它们的表达量在茶叶加工过程中会发生显著变化18-19。此外，茶树 NCED 成员在茶树对低温20和干旱胁迫21-22的响应过程中也发挥着重要作用，但茶树中 NCED 响应胁迫条件的转录调控机制 还 有 待 进 一 步 研 究。本 研 究 通 过 对CsNCED2 上游调控因子进行挖掘，并探究它们在不同胁迫下的表达模式，以期为进一步了解 CsNCED2 响应胁迫的转录机制奠定基础。1 材料与方法材料与方法 1.1 试验材料与处理方法 试验材料为一年生龙井长叶无性系水培苗，培养于西北农林科技大学科研温室。培养条件为白天 25，晚上 22，自然光照；选取健康且长势一致的茶苗进行不同胁迫处理。盐、干旱处理：将茶苗根部用水洗净后移入配制好的 NaCl（200 mmolL-1）和 20%PEG 6000溶液中分别进行高盐和干旱胁迫；低温处理：使用光照培养箱进行 4 低温胁迫。3 个处理均在处理后 0、1、4、6、8、12、24、48 h 剪取幼嫩叶片，用液氮快速冷冻后保存于80 冰箱用于提取 RNA，每个时间点的样品均设置 3 个生物学重复。1.2 酵母单杂交文库筛选 用课题组前期克隆的 CsNCED2 的启动子做模板，将836 至1415 区域构建至 pABAi载体上获得诱饵载体（引物见表 1）。用限制性内切酶 BstbI 线性化诱饵载体并转化至Y1HGold 酵母中，涂布于 SD/-Ura 培养基，30 培养 3 d。挑取单克隆用 Matchmaker Insert Check PCR Mix 1 进行菌落 PCR 鉴定，获得诱饵菌株 Y1H-pAbAi-proCsNCED2。取适量 Y1H-pAbAi-proCsNCED2 涂布于含有不同金担子素 A（Aureobasidin A，AbA）浓度的 SD/-Ura 培养基上，30 倒置培养 3 d，观察菌落的生长情况，以确定能够完全抑制Y1H-pAbAi-proCsNCED2 自激活的 AbA 浓度。按照 SK2400 经典酵母转化试剂盒（酷来搏，北京）说明书制作 Y1H-pAbAi-proCsNCED2感受态细胞，并转化本实验室前期构建的茶树叶片文库质粒，转化后的菌涂布于 SD/-Leu3 期 李佳思，等：茶树 CsNCED2 启动子互作转录因子筛选及在非生物胁迫中的响应 327 （100 ngmL-1 AbA）培养基上，30 倒置培养 3 d 后，挑取单克隆进行 PCR 扩增，并对PCR 产物进行测序鉴定。1.3 酵母单杂交点对点验证互作蛋白 测序信息提交到 NCBI进行 BLASTx比对后，根据候选转录因子 CsDof5.4（GenBank登 录 号XP_028116390.1）和CsERF38（GenBank 登录号 XP_028084536.1）序列信息设计特异引物（表 1），以龙井长叶 cDNA为模板将它们的编码序列（CDS）构建至pGADT7(AD)载 体 上，形 成 AD-Dof5.4 和AD-ERF38重 组 载 体，并 转 化 至Y1H-pAbAi-proCsNCED2 感受态细胞中，涂布于 SD/-Leu（100 ngmL-1 AbA）培养基上，30 培养 3 d，观察菌斑生长状况，AD 空载体转化 Y1H-pAbAi-proNCED2 菌株为阴性对照。1.4 转录活性鉴定 设计特异引物（表 1）将 CsDof5.4 与CsERF38 的 CDS 序列构建至 pGBKT7(BD)载体，获得 BD-Dof5.4 与 BD-ERF38 重组载体，并将它们分别转化入 Y2HGold 酵母感受态细胞中，涂布于 SD/-Trp 培养基，30 培养 3 d，将长出的单克隆转移至SD/-Trp-His-Ade(X-a-gal)培养基上，30 条件下进行培养，观察它们的生长状态及颜色变化。转化有 BD 空载体的 Y2HGold 酵母菌作为阴性对照。1.5 亚细胞定位分析 设 计 特 异 引 物（表1）构 建35S:CsDof5.4-GFP 和 35S:CsERF38-GFP 用于亚细胞定位试验。将 35S:CsDof5.4-GFP、35S:CsERF38-GFP 和 35S:GFP 分别转化至根癌农杆菌 GV3101 中，在 28 分别培养至浑浊后，3 000 rmin-1离心 5 min，弃去培养基，用侵染液（10 mmolL-1 MgCl2，10 mmolL-1 MES，120 molL-1 AS，pH=5.7）分别重悬菌体至 OD600为 0.8