柳树品种微卫星标记鉴别技术规程 LYT 3107-2019.pdf

1CS65.020.20B61LY中华人民共和国林业行业标准LY/T3107-2019柳树品种微卫星标记鉴别技术规程Technical regulation for willow varieties identification by SSR markers2019-10-23发布2020-04-01实施国家林业和草原局发布LY/T3107-20193.3DNA提取DNA提取采用改良的CTAB法：a)向2mL离心管中加入400 L CTAB裂解液，10L的10mg/mL Rnase,2LB巯基乙醇。b)取柳树叶片3片5片，放入研钵中加入液氮充分研磨，将研磨后的样品转入3.2.1的离心管中，涡旋混匀后，65保温10min,再加入400L2%SDS,涡旋混匀，65保温10min。c)向3.2.2的离心管中加人130L5mo/L酷酸钾，涡旋混匀，将离心管插入冰中保存10min。d)加入800L氯仿异戊醇溶液（氯仿：异戊醇=24：1），涡旋混匀后，12000r/min高心5min。)将上清液转移到新的2mL离心管中，加人等体积预冷的异丙醇，颠倒离心管8次10次，一20冻存20min。D取出离心管，12000r/min离心5min,去除上清液。g)加人500L的70%乙醇，12000r/min离心2min,去除上清液。h)重复3.2.7步骤一次。i)加入500L无水乙醇，12000r/min离心5min,去除上清液，离心管开盖室温放置30min。j)加入100LTE缓冲液，37保存5min,涡旋混匀获得DNA,将样品放在一80长期保存。3.4DNA定量及质量检测3.4.1取2LDNA用微量核酸蛋白检测仪检测，直接读出DNA浓度和A260/280的比值。3.4.2根据上述测定浓度，取200 ng DNA,加入2L溴酚蓝，在1%的琼脂糖凝胶上电泳，加入5000 bp marker作对照，稳压100V,电泳缓冲液为1TBE,电泳结束后用凝胶成像系统记录拍照。3.4.3根据微量核酸蛋白检测仪的定量结果，将样品稀释成20ng/L,在一20下保存备用。3.5目的片段PCR扩增3.5.116对SSR引物及序列参见附录B。3.5.2目的片段扩增反应体系为15L,具体试剂用量见表1。表1PCR扩增反应体系试剂浓度所需体积/LPCR buffer10X PCR buffer(Mg+Plus)1.5Taq酶5 U/pL0.2Forward Primer5 mmol/L1Revere Primer5 mmol/L1DNA20 ng/uL2dNTP5 mmol/L0.3dUTP250 nmol/L1H2O6.83.5.3PCR扩增反应将配制的扩增体系加入到8连管或96孔PCR板中，盖上管盖后涡旋混匀，在3000r/min下离心5s,放人PCR仪中扩增，扩增程序为：a)94变性4min:2LY/T3107-2019b)94变性30s,55退火30s,72延伸1min,共35个循环；c)72延伸10min,15保存。3.6目的片段检测3.6.1PCR产物变性PCR产物用双蒸水稀释10倍15倍，取1L稀释产物加人到9L的Loading buffer(91%超纯甲酰胶，9%内标Genescan500Rox)后混匀，在PCR仪上运行变性程序：95变性5min,迅速放冰上冷却。3.6.2PCR扩增产物检测PCR产物检测采用ABI PRISM3130 x】分析系统。从数据采集软件中创建一个片段分析程序，选择片段分析模式以及光谱校正所用试剂盒类型。创建一个自动分析模板，填写分析样品名称，选择样品类型、内标类型、分析方法等。将变性的产物转入96孔PCR板，盖上仪器自带的PCR板盖，放入仪器中。在软件中将PCR板链接到仪器，点击开始进行基因型分型。3.6.3PCR扩增产物条带分析采用基因型分析软件打开基因型分型的结果，根据内参大小直接读出每个样品目的片段的大小。4送检样品分析4.1随机选取表B.1中的一对SSR引物，对待检样品进行PCR扩增。4.2将待检样品扩增得到的条带和表C.1、表C2中对应引物的标准普带相比较。4.3如果所有扩增条带和表C1、表C,2中对应引物某一品种的标准谱带完全相同，即判定为相同品种；如果扩增条带和其中几个品种的条带完全相同，则增加一对引物进行检测，直至检测到唯一匹配的品种。4.4如果待检样品所有扩增条带有一个以上位点与标准谱带不同，即判定为不同品种。4.5根据基因型频率判定所鉴定品种真实性的准确率，参见附录D。3